陳婷婷，應(yīng)佚倫，崔凌飛，鐘誠(chéng)兵，胡正利，顧 震，龍億濤*

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

單個(gè)生物分子是影響和調(diào)控生命功能的基本單元之一，理解和研究單個(gè)生物分子可解析微觀尺寸下生命活動(dòng)的基本特性[1-5]。現(xiàn)有單分子檢測(cè)方法主要為原子力顯微鏡[6]、單分子熒光檢測(cè)技術(shù)[7]、掃描隧道顯微鏡[8]等?；谶@些方法，可以實(shí)現(xiàn)在單分子水平上對(duì)核酸(如DNA、RNA)及蛋白質(zhì)等生物大分子及其相互作用的檢測(cè)和分析。納米孔道分析技術(shù)作為一種基于納米孔道限域效應(yīng)的單分子測(cè)量技術(shù)[9-12]，具有通量高、尺寸小、無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需真空環(huán)境、靈敏度高及成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被用于DNA分析[13-16]、RNA檢測(cè)[17-18]、蛋白質(zhì)識(shí)別[19-20]及單分子反應(yīng)研究等[21-24]。如利用野生型的Aerolysin納米孔道，不僅可以分辨長(zhǎng)度為2到10個(gè)堿基的單個(gè)核苷酸，還可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸外切酶Ⅰ逐步裂解核酸的過(guò)程[25-26]。利用α-溶血素(α-Hemolysin,α-HL)納米孔道可檢測(cè)不同長(zhǎng)度的類膠原肽以及區(qū)分其構(gòu)型，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)混合體系中3種分析物的同時(shí)檢測(cè)[20]。納米孔道獲取納米尺度信息是基于對(duì)皮安級(jí)微弱電流和毫秒級(jí)時(shí)間分辨實(shí)現(xiàn)的。這種微弱電流信號(hào)的放大、快速獲取和高效儲(chǔ)存對(duì)納米孔道檢測(cè)儀器提出了巨大的挑戰(zhàn)：首先，儀器裝置需要極高的電流分辨(皮安級(jí))[27]和極高的帶寬(>5 kHz)[28]，用于保證單分子信號(hào)測(cè)量的靈敏度和可靠性；其次，測(cè)量?jī)x器需要穩(wěn)定性好、信噪比高，以及可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單分子檢測(cè)操作；再者，樣品現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量需要檢測(cè)設(shè)備體積小、便攜且對(duì)檢測(cè)環(huán)境無(wú)特殊要求。然而，現(xiàn)有的商品化電化學(xué)儀器均難以同時(shí)滿足以上3點(diǎn)。尤其是，儀器帶寬的提高往往意味著測(cè)量噪音的增加，而儀器體積較大不易于滿足現(xiàn)場(chǎng)納米孔道實(shí)驗(yàn)的需求，且對(duì)防震臺(tái)、接地系統(tǒng)等條件的需求降低了納米孔道儀器裝置的普適性。因而，亟需一種新型的單分子檢測(cè)手段和通用型超靈敏儀器設(shè)備。

本課題組研制的Cube系列納米孔道儀器具有低噪音測(cè)量、集成化設(shè)計(jì)、高時(shí)間分辨率、高電流分辨的特點(diǎn)[29]，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)分子在納米孔道內(nèi)產(chǎn)生的微弱阻斷信號(hào)進(jìn)行高通量、高帶寬的實(shí)時(shí)采集，且儀器體積小巧，便于攜帶，適合多種檢測(cè)環(huán)境[28,30]。Cube系列納米孔道儀器的特點(diǎn)具體如下：(1)設(shè)計(jì)電阻反饋式的前置放大器電路，將微弱電流信號(hào)放大再轉(zhuǎn)換成較大的電壓信號(hào)，并傳輸?shù)胶罄m(xù)電路進(jìn)行處理，避免微弱信號(hào)被噪聲覆蓋；(2)引入頻率補(bǔ)償電路，消除寄生電容和輸入電容對(duì)信號(hào)帶寬產(chǎn)生的影響，提高儀器的時(shí)間分辨和電流分辨能力；(3)采用電池對(duì)前置放大器單獨(dú)供電，設(shè)計(jì)電壓調(diào)理電路，降低電源噪音和電壓波動(dòng)產(chǎn)生的干擾，使儀器可在普通實(shí)驗(yàn)室使用；(4)設(shè)計(jì)基于現(xiàn)場(chǎng)可編程邏輯門陣列(Field programmable gate array,FPGA)的高速數(shù)據(jù)采集電路，利用軟件改變芯片內(nèi)部邏輯門的連接方式和邏輯運(yùn)算方法，達(dá)到實(shí)現(xiàn)定制信號(hào)處理的功能，實(shí)現(xiàn)高速同步的數(shù)據(jù)采集；(5)整體儀器采用高度集成化設(shè)計(jì)，使其整體尺寸小于12 cm，以實(shí)現(xiàn)測(cè)量屏蔽系統(tǒng)及儀器的便攜化。

為了驗(yàn)證Cube系列納米孔道儀器的穩(wěn)定性和靈敏性，本文選擇氣單胞菌溶素(Aerolysin)生物納米孔道作為測(cè)量所用納米孔道。相比于較常用的α-HL[31]、恥垢分枝桿菌蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin A,MspA)孔道[32]，Aerolysin具有孔徑窄，且孔道內(nèi)含大量帶電氨基酸等優(yōu)勢(shì)，使其在生物分子分析中具有極高的靈敏性、空間分辨率以及構(gòu)型穩(wěn)定性，從而被廣泛地應(yīng)用于小分子核酸、多肽的檢測(cè)分析[33]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氯化鉀(≥99.5%)、正癸烷(無(wú)水，≥99%)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鹽酸(36.0%～38.0%)、乙二胺四乙酸(99.995%)、磷酸鈉(≥98%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，≥99.9%)均購(gòu)于上海阿拉丁試劑公司；1,2-二植烷酰基磷脂(200 mg)購(gòu)于美國(guó)Avanti Polar Lipid Inc.公司，儲(chǔ)存條件為-20 ℃；野生型Aerolysin用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)配置成質(zhì)量濃度為10 μg/mL蛋白溶液，存于-20 ℃冰箱備用；實(shí)驗(yàn)所用待測(cè)Poly(dA)4的序列為5’-AAAA-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并通過(guò)高效液相色譜提純，儲(chǔ)存條件為-20 ℃；實(shí)驗(yàn)用水均為由Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備得到電阻 率為18 MΩ·cm(25 ℃)的超純水。

Bilayer perfusion chamber(BCH-P)檢測(cè)池(美國(guó)Warner Instruments公司)，由cis和trans兩腔室組成，兩個(gè)腔室的容積均為1 mL，其中trans腔室中央弧形區(qū)域中有1個(gè)直徑為50 μm的孔用于構(gòu)建磷脂雙分子層以及蛋白納米孔道；實(shí)驗(yàn)所采用的Ag/AgCl電極通過(guò)電鍍法制得，銀絲直徑為1.0 mm，購(gòu)于英國(guó)Alfa Aesar公司；ClampFit 10.3數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Molecular Devices公司)；Nanopore Analysis數(shù)據(jù)處理軟件(實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)，下載網(wǎng)址為https://hysz.nju.edu.cn/ytlong/65/2a/c36917a484650/page.htm)；Origin 9.0(美國(guó)OriginLab Corporation 公司)；Cube系列超低電流納米孔道分析儀(Cube-01，實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā))；高阻值電阻(1 GΩ)；膜片鉗儀器系統(tǒng)(美國(guó)Molecular Devices公司)，包含電流放大器Axonpatch 200B和數(shù)模轉(zhuǎn)換器Digidata 1440A。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 1 GΩ電阻測(cè)量Cube納米孔道儀器分為信號(hào)處理主機(jī)和前置電流放大器兩部分(圖1A)，其尺寸分別為12 cm×12 cm×8 cm及7.5 cm×5.5 cm×12.6 cm。其中前置電流放大器設(shè)計(jì)有電池槽、前置探頭、電極連接件、納米通道檢測(cè)池及屏蔽箱，高集成化屏蔽箱的存在可極大的消除外部電磁噪音干擾。

將電池放入電池槽，將1 GΩ電阻用鱷魚(yú)夾與兩電極相連后，通過(guò)連接線將探頭與電池槽相連，用USB數(shù)據(jù)線將主機(jī)與電腦相連，主機(jī)指示燈亮，用音頻線將主機(jī)與探頭相連(圖1A)，打開(kāi)探頭開(kāi)關(guān)，探頭指示燈亮。

圖1 Cube納米孔道儀器(A)及軟件運(yùn)行界面截圖(B)Fig.1 Cube ultrasensitive nanopore instrument (A) and software operation interface screenshot(B)

啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的Smart Nanopore軟件，圖1B為軟件界面截圖，具體操作步驟如下：(1)從左向右依次點(diǎn)兩個(gè)連接開(kāi)關(guān)(圖1B-①)，符號(hào)由灰變綠則表示連接成功，否則需要檢查連接問(wèn)題；(2)連接成功后根據(jù)所連的儀器標(biāo)識(shí)參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣設(shè)置(圖1B-②)；(3)設(shè)置結(jié)束后點(diǎn)擊Start按鈕，軟件開(kāi)始運(yùn)行,圖1B-⑥電流顯示界面、1B-⑧電壓顯示界面分別出現(xiàn)相應(yīng)的電流、電壓曲線；(4)通過(guò)圖1B-③處進(jìn)行電壓施加設(shè)置，分別通過(guò)圖1B中的⑤、⑦、⑨調(diào)節(jié)電流顯示、電壓顯示、時(shí)間尺度；(5)點(diǎn)擊圖1B-④處“Conf.”按鈕設(shè)置數(shù)據(jù)存儲(chǔ)路徑以及文件名，點(diǎn)擊“Rec.”按鈕開(kāi)始或停止記錄。

以上步驟均完成后，開(kāi)始記錄1 GΩ電阻的測(cè)量信息。在5 kHz濾波下，施加電壓由0 mV變至200 mV，再由0 mV變至-200 mV，每次變化值Δ=10 mV，時(shí)間間隔5 s，記錄電流隨電壓的變化曲線。一般為了表征納米孔道的電化學(xué)性質(zhì)，可繪制其不同電壓下的電流響應(yīng)曲線，即I～V曲線[32]。因此，這里對(duì)1 GΩ電阻用相同的方法表征，同時(shí)記錄下電流噪音均方根(RMS)值，并計(jì)算一個(gè)周期內(nèi)電流噪音信號(hào)最高值和最低值之間的差值，即電流噪音峰-峰(Peak-Peak)值。分別將濾波變?yōu)?0、100 kHz，重復(fù)以上步驟。

1.2.2 納米孔道實(shí)驗(yàn)組裝cis和trans腔室成檢測(cè)池，在兩端分別注入1 mL Tris-KCl溶液，并置入Ag/AgCl電極，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，施加電壓調(diào)至100 mV。將磷脂溶液均勻涂抹在檢測(cè)池的微孔處，形成磷脂雙分子層，根據(jù)擊破電壓調(diào)節(jié)至合適的膜厚。在200 mV電壓下，在cis端近微孔處小心快速注入0.5～2.0 μL的Aerolysin蛋白溶液，待自組裝形成單個(gè)納米孔道后，記錄5、10、100 kHz 3個(gè)濾波下的I～V曲線、RMS值。在10 kHz濾波、20 mV電壓下，在cis端緩慢注入20 μL Poly(dA)4溶液，使其終濃度為2 μmol/L，分別記錄100、120、140、160、180 mV下的納米孔道單分子阻斷電流變化。

以上實(shí)驗(yàn)均在溫度(22.0±0.5) ℃，濕度45%±5%條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器穩(wěn)定性測(cè)試

納米孔道單分子電化學(xué)測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性評(píng)估主要考慮環(huán)境噪音干擾，例如不同時(shí)刻外界震動(dòng)、溫度、濕度、電磁場(chǎng)等變化造成的納米孔道實(shí)驗(yàn)噪音干擾等。為了驗(yàn)證納米孔道儀器的穩(wěn)定性，本研究首先通過(guò)在Cube納米孔道儀器的電極端接入1 GΩ電阻進(jìn)行噪音評(píng)估，即測(cè)量并比較不同時(shí)間內(nèi)、不同截止頻率下儀器的RMS及Peak-Peak水平。

電壓通過(guò)雙電極體系施加在電阻兩側(cè)，其中一側(cè)為工作電極，另一側(cè)接地，工作電極通過(guò)放大器系統(tǒng)改變施加電壓；同時(shí)，電流通過(guò)工作電極接入放大器系統(tǒng)，并經(jīng)過(guò)前置放大、信號(hào)調(diào)理和模數(shù)轉(zhuǎn)換采集到計(jì)算機(jī)(圖2A)。納米孔道儀器的貝塞爾低通濾波電路可對(duì)輸入信號(hào)進(jìn)行降噪處理，如圖2B所示，在施加電壓為0 mV的條件下，改變儀器的截止頻率，隨著截止頻率的增加(5、10、100 kHz)，Peak-Peak值、RMS值也隨之增加，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[25]。

圖2 使用電阻驗(yàn)證Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性。儀器系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案(A)；在不同截止頻率、0 mV電壓下， 電阻的基線電流(B)、Peak-Peak值(C)、RMS值(D)；以5 kHz截止頻率為例，5天穩(wěn)定性測(cè)試的I～V 曲線(E)；不同截止頻率下，5天內(nèi)測(cè)得的電阻的電導(dǎo)(F)Fig.2 Stability test of the Cube ultrasensitive nanopore instrument verified using a resistor.Instrument system design(A); Baseline current(B),Peak-Peak value(C),RMS value(D) of the resistor at different cut-off frequencies under the potential of 0 mV;I-V curve(5-days stability test,taking 5 kHz as an example)(E);Conductance values of the resistance at different cut-off frequencies in 5 days(F)

連續(xù)5天進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得在5、10、100 kHz 3種截止頻率下(施加電壓為0 mV)的Peak-Peak值分別為(1.70±0.12)、(2.14±0.17)、(69.20±20.08) pA；電流基線的RMS值分別為0.2±0.0、0.3±0.0、9.4±2.3(圖2C-D)。在商品化儀器中進(jìn)行相同重復(fù)實(shí)驗(yàn)，Peak-Peak值分別為(3.87±0.12)、(7.83±0.29)、(90.00±5.00) pA；RMS值分別為(1.0±0.2)、(2.4±0.5)、(18.1±3.3) pA。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在5、10、100 kHz條件下，Cube納米孔道儀器獲取的電流基線的RMS值分別比商品化儀器減少了80.0%、87.5%、48.2%，RMS值測(cè)量誤差波動(dòng)也遠(yuǎn)小于該商品化儀器，這說(shuō)明Cube納米孔道儀器的控制噪音能力更強(qiáng)，測(cè)量穩(wěn)定性更好。為了進(jìn)一步說(shuō)明Cube納米孔道儀器在不同電壓下的穩(wěn)定性，在5 kHz濾波下，獲取連續(xù)5天的I～V曲線(如圖2E)，并分別在5、10、100 kHz 3種截止頻率條件下進(jìn)行5天穩(wěn)定性測(cè)試(如圖2F)，計(jì)算得到電導(dǎo)分別為(1.00±0.0 1)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，測(cè)量誤差均小于1.0%，結(jié)果表明儀器運(yùn)行穩(wěn)定，不隨環(huán)境時(shí)間和施加電壓的變化而產(chǎn)生強(qiáng)烈的電流測(cè)量波動(dòng)。

2.2 Aerolysin納米孔道檢測(cè)Poly(dA)4

以檢測(cè)Poly(dA)4為例，驗(yàn)證了Cube納米孔道儀器在納米孔道檢測(cè)過(guò)程中的運(yùn)行情況(如圖3A所示)。圖3B表示在0 mV施加電壓下5、10、100 kHz濾波的電流基線，并計(jì)算得到Peak-Peak值分別為(2.88±0.11)、(4.01±0.62)、(300.90±63.20) pA；RMS值分別為(0.4±0.1)、(0.5±0.1)、(30.0±4.6) pA。為進(jìn)一步說(shuō)明Cube納米孔道儀器在納米孔道檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定性，分別在5、10、100 kHz 3種截止頻率下進(jìn)行5天納米孔道的穩(wěn)定性測(cè)試，其中在5 kHz濾波下得到I～V曲線如圖3C，分別計(jì)算得到電導(dǎo)為(0.53±0.01)、(0.53±0.01)、(0.53±0.01) nS(如圖3D)，測(cè)量誤差均小于2.4%，結(jié)果表明儀器測(cè)量基本穩(wěn)定。選取3天不同的施加電壓值(0～180 mV，ΔV=10 mV)，計(jì)算施加電壓值的實(shí)際值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，由不同的實(shí)際電壓的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.014 mV，占施加電壓變化量(10 mV)的0.14%，表明該儀器的誤差較小，可用于超靈敏的電化學(xué)測(cè)量實(shí)驗(yàn)。

圖3 Aerolysin納米孔道檢測(cè)Poly(dA)4的示意圖(A);不同截止頻率下，單個(gè)Aerolysin納米孔道的 電流基線(B);5 kHz下，Aerolysin納米孔道5天穩(wěn)定性測(cè)試的I～V曲線(C)； 5天穩(wěn)定性測(cè)試的不同頻率下Aerolysin納米孔道的電導(dǎo)(D)Fig.3 Schematic diagram of poly(dA)4 detection by an Aerolysin nanopore(A);Current baseline of a single Aerolysin nanopore at different cut-off frequencies(B);I-V curve of an Aerolysin nanopore

Aerolysin納米孔檢測(cè)Poly(dA)4得到的原始數(shù)據(jù)為時(shí)間電流曲線(圖4A)，定義未通過(guò)待測(cè)物時(shí)刻的電流值為納米孔道開(kāi)孔電流I0，當(dāng)有待測(cè)物通過(guò)孔道時(shí)的殘余電流值為I，持續(xù)時(shí)間為阻斷時(shí)間(Duration time)，待測(cè)物過(guò)孔的殘余電流程度為I/I0。統(tǒng)計(jì)分析過(guò)孔信號(hào)的時(shí)間和電流可以得到不同電壓下待測(cè)物過(guò)孔的阻斷時(shí)間、殘余電流程度等信息，并繪制了阻斷時(shí)間統(tǒng)計(jì)直方圖、殘余電流程度統(tǒng)計(jì)直方圖(圖4B、C)。統(tǒng)計(jì)不同電壓(100、120、140、160、180 mV)下的阻斷信息，阻斷時(shí)間分別為(7.33±0.15)、(4.85±0.28)、(3.53±0.05)、(2.53±0.04)、(2.23±0.04) ms；殘余電流程度分別為0.48±0.00、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.00、0.57±0.01。圖4D為利用商品化儀器獲取不同施加電壓下的阻斷信號(hào)，并選取與Cube儀器得到的相同個(gè)數(shù)的信號(hào)，繪制殘余電流程度統(tǒng)計(jì)直方圖，其殘余電流程度分別為0.47±0.01、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.01、0.57±0.01。分別對(duì)比Cube納米孔道儀器和商品化儀器在不同施加電壓下獲取信號(hào)的殘余電流程度，兩者數(shù)值誤差均不超過(guò)0.01，說(shuō)明Cube納米孔道儀器可應(yīng)用于納米孔道分析實(shí)驗(yàn)。

圖4 Poly(dA)4通過(guò)Aerolysin納米孔道的原始電流軌跡圖(A)；不同電壓下，Poly(dA)4的阻斷時(shí)間(B)和殘余 電流程度(C)統(tǒng)計(jì)直方圖；商品化儀器得到的Poly(dA)4在不同電壓下的殘余電流程度統(tǒng)計(jì)直方圖(D)Fig.4 Original current traces of Poly(dA)4 traversing across an aerolysin nanopore(A);Statistical histograms of duration times(B) and residual current blockages(C) at different voltages;Statistical histograms of residual current blockages at different voltages obtained by commercial instrument(D)

進(jìn)一步分析Cube納米孔道儀器在100 mV下獲取的Poly(dA)4穿過(guò)Aerolysin納米孔道信號(hào)，其殘余電流程度為0.48±0.01。文獻(xiàn)使用商品化儀器在相同條件下所得的殘余電流程度為0.48±0.01[25]，兩者殘余電流程度一致，結(jié)果高度吻合。進(jìn)一步表明基于Cube納米孔道儀器的生物納米孔實(shí)驗(yàn)具備高度可重復(fù)性，數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

如圖5所示，采用Cube納米孔道儀器在1周的不同3天進(jìn)行穩(wěn)定性納米孔實(shí)驗(yàn)。對(duì)獲取信號(hào)的殘余電流程度和阻斷時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并擬合，得到不同時(shí)間測(cè)得同一施加電壓下的殘余電流程度，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.004，占?xì)堄嚯娏鞒潭鹊陌俜直?，即?duì)殘余電流程度測(cè)量影響小于0.6%。本實(shí)驗(yàn)中，Poly(dA)4信號(hào)的阻斷時(shí)間隨電壓升高而減小，因此其在180 mV電壓下具有最小的阻斷時(shí)間。通過(guò)比較在180 mV電壓下阻斷時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差占相應(yīng)阻斷時(shí)間的百分比，顯示其最大值僅為2.8%，說(shuō)明Cube納米孔道儀器檢測(cè)誤差對(duì)瞬時(shí)納米孔信號(hào)的失真度影響小，具有高準(zhǔn)確性。

圖5 以Aerolysin測(cè)量Poly(dA)4為例時(shí)，Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性測(cè)試;不同電壓下Poly(dA)4殘余電流阻斷 程度(A)和阻斷時(shí)間(B)的統(tǒng)計(jì)平均值Fig.5 Instrument stability test of Cube nanopore instrument for aerolysin detection of Poly(dA)4;Averaged statistical residual current blockages(A) and duration times(B) of Poly(dA)4 under different voltages

3 結(jié) 論

本研究主要考察了Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性及其在納米孔道檢測(cè)中的應(yīng)用。在截止頻率為5、10、100 kHz條件下，電流基線的噪音均方根(RMS)值分別比商品化儀器減小了80.0%、87.5%、48.2%，說(shuō)明Cube納米孔道儀器的抑制噪音能力更強(qiáng)，儀器測(cè)量穩(wěn)定性更好。在連續(xù)穩(wěn)定性測(cè)試中，Cube由I～V曲線得到在5、10、100 kHz截止頻率下電阻的電導(dǎo)為(1.00±0.01)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，測(cè)量誤差均小于1.0%，而商品化儀器得到電導(dǎo)為(0.94±0.01) nS，說(shuō)明Cube納米孔道儀器滿足納米孔道實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的穩(wěn)定性要求。在納米孔道檢測(cè)的應(yīng)用中，通過(guò)Aerolysin納米孔道檢測(cè)Poly(dA)4的實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Cube儀器和商品化儀器在不同施加電壓下獲取的單分子信號(hào)殘余電流程度，兩者誤差均小于0.01；100 mV時(shí)待測(cè)物Poly(dA)4過(guò)Aerolysin納米孔的信號(hào)經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到的殘余電流程度為0.48±0.01，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[25]，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果具有較高的可重復(fù)性。Cube納米孔道儀器憑借其高帶寬、噪音低、體積小的優(yōu)勢(shì)以及其特殊的分體式結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，保證了其電流檢測(cè)的穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境外的便攜式現(xiàn)場(chǎng)快速納米孔道檢測(cè)，以期可應(yīng)用于臨床即時(shí)檢驗(yàn)等。