吳 宇，葉 金,*，李 麗，李 森，軒志宏，崔 華，劉洪美，王松雪,*，馬海華，張 峰，何建洪

（1.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；2.河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.?？苾x器（廈門）有限公司，福建 廈門 361000）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是小麥和玉米等作物受到鐮刀菌污染后產(chǎn)生的一種真菌毒素[1]，具有類雌激素作用，影響動(dòng)物的繁殖功能[2]，具有免疫毒性和遺傳毒性[3]，有潛在致癌性[4]。胡佳薇等[5]對(duì)陜西省10 個(gè)地市隨機(jī)采集市售谷物及其制品、玉米油等進(jìn)行檢測(cè)，ZEN總檢出率為17.27%，玉米油的檢出率為79.37%，均值為149 μg/kg，谷物制品中有12 份樣品超標(biāo)，超標(biāo)率為1.64%。Piacentini等[6]對(duì)巴西76 份釀造用大麥中ZEN含量進(jìn)行檢測(cè)，ZEN檢出率為73.5%，檢出值在 300～630 μg/kg。因此需要簡(jiǎn)單、高效、精確的檢測(cè)方法對(duì)糧油中ZEN污染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

目前，食品中ZEN的檢測(cè)方法有薄層色譜法[7-9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10-13]、氣相色譜質(zhì)譜法[14-18]、高效液相色譜法[19-23]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[24-31]。其中薄層色譜法由于精密度低、操作規(guī)程復(fù)雜耗時(shí)、分析結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性差，已經(jīng)逐漸被其他儀器方法所取代。酶聯(lián)免疫吸附法方便、快捷、靈敏度高，可以作為快檢方法使用，但是容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。氣相色譜法適用于揮發(fā)性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好的真菌毒素檢測(cè)，ZEN不易揮發(fā)，需要在進(jìn)入氣相色譜柱前進(jìn)行氮吹濃縮和衍生，步驟繁瑣，因此在真菌毒素檢測(cè)方面應(yīng)用并不廣泛。高效液相色譜法是真菌毒素檢測(cè)中最常用的方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是容易受到干擾導(dǎo)致檢測(cè)假陽(yáng)性。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可以提高分析的靈敏度和穩(wěn)定性，具有分析速度快、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠避免假陽(yáng)性準(zhǔn)確高效進(jìn)行定性定量檢測(cè)，受到廣泛使用。

本研究將免疫親和柱凈化步驟自動(dòng)化，用全碳標(biāo)記穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量校正加標(biāo)回收率及儀器基質(zhì)效應(yīng)，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法精確測(cè)定糧油中的ZEN。本方法無(wú)需氮吹、可批量自動(dòng)化處理樣品36 個(gè)，實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守，提高工作效率，同時(shí)避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，提高方法精密度；內(nèi)標(biāo)法定量校正加標(biāo)回收率及儀器基質(zhì)效應(yīng)，提高方法準(zhǔn)確性。可用于實(shí)驗(yàn)室能力比對(duì)及標(biāo)物研制過(guò)程中的準(zhǔn)確定值及均一性檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；磷酸鹽緩沖液鹽包、吐溫-20（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；超純水 廣州Waston公司；ZEN免疫親和柱 中檢維康公司；同位素內(nèi)標(biāo)13C18-ZEN（25 μg/mL） Romer國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；甲醇ZEN（20.52 μg/mL， 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100301）、玉米全粉ZEN（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100385）、全麥粉ZEN（質(zhì)控樣品Wheat-ZEN-2018）、玉米油中ZEN（質(zhì)控樣品Corn Oil-ZEN-2018）、大米粉ZEN和黃曲霉毒素（質(zhì)控樣品RICE-ZEN&AFB1-2018）、糙米粉ZEN（質(zhì)控樣品Brown rice-ZEN-2018）、玉米全粉空白（質(zhì)控樣品Corn-Toxin-NK）、全麥粉空白（質(zhì)控樣品Wheat-Toxin-NK）、大米粉空白（質(zhì)控樣品Rice-Toxin-NK）、糙米粉空白（質(zhì)控樣品Brown rice-Toxin-NK）、玉米油空白（質(zhì)控樣品Corn oil-Toxin-NK） 國(guó)家糧食與物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀 ?？苾x器有限公司；Q-Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；3-30K離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；GT10-1高速臺(tái)式離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；多管渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為甲醇，B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨溶液，流速0.3 mL/min。 梯度洗脫條件：0 ～6 m i n，3 0%～5 0% A，7 0%～5 0% B；6 ～6.1 m i n，5 0%～9 5% A，50%～5% B；6.1～7 min，95% A，5% B；7～7.1 min，95%～30% A，5%～70% B；7.1～10 min，30% A，70% B。流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子源：溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓3.2 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；鞘氣35 unit；輔助氣10 unit；Targeted-SIM模式；極性：正離子模式；掃描范圍m/z250～800；分辨率70 000；自動(dòng)增益控制5×105；最大駐留時(shí)間20 ms；同時(shí)掃描的母離子數(shù)5；質(zhì)荷比寬度m/z1.5。

1.3.3 樣品前處理

全自動(dòng)固相萃取儀前處理法：準(zhǔn)確稱取（5±0.01）g 樣品，加入20 mL 90%乙腈溶液，渦旋提取20 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1% PBST緩沖液，7 000 r/min離心5 min，取20 mL過(guò)濾液于全自動(dòng)固相萃取儀的80 mL上樣管內(nèi)，運(yùn)行編好的方法對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)凈化（具體步驟詳見(jiàn)表1，甲醇洗脫體積為2 mL），過(guò)膜上機(jī)檢測(cè)。

表1 全自動(dòng)固相萃取儀免疫親和柱凈化程序Table 1 Purification programs of automatic solid phase extraction apparatus with immunoaffinity columns

1.3.4 樣品ZEN含量測(cè)定

準(zhǔn)確移取ZEN標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成不同質(zhì)量濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取180 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入20 μL13C18-ZEN穩(wěn)定同位素工作液于400 μL內(nèi)插管中。將待測(cè)試樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行檢測(cè)，得到ZEN及13C18-ZEN的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的ZEN與13C18-ZEN峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中ZEN質(zhì)量濃度。試樣中ZEN含量按下式計(jì)算：

式中：X為樣品中ZEN含量/（μg/kg）；ρ為樣品測(cè)定液中ZEN質(zhì)量濃度/（ng/mL）；f為稀釋因子8；m為試樣的稱樣量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣流速優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察玉米基質(zhì)加標(biāo)稀釋液在上樣流速為2、4、6、8 mL/min時(shí)的柱回收率，結(jié)果如圖1所示，流速為2～8 mL/min時(shí)，回收率在95.2%～101.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.7%～3.8%之間。因此選擇8 mL/min的流速，即縮短上樣時(shí)間，又保證回收率最佳。

圖1 上樣流速對(duì)ZEN回收率的影響Fig. 1 Effect of sample loading flow rate on ZEN recovery

2.2 氣推次數(shù)的優(yōu)化

淋洗之后，柱子內(nèi)的殘留液體是否推得干凈是影響回收率的關(guān)鍵因素，因此優(yōu)化淋洗之后的氣推次數(shù)保證柱子吹干至關(guān)重要，結(jié)果如圖2所示，以80 mL/min流速氣推3 次后柱子質(zhì)量不再變化，說(shuō)明柱子吹干。

圖2 氣推次數(shù)對(duì)柱子吹干情況的影響Fig. 2 Effect of number of pushing cycles on column mass

2.3 洗脫體積準(zhǔn)確性考察結(jié)果

用全自動(dòng)固相萃取儀考察1 mL甲醇洗脫免疫親和柱，接收洗脫液于10 mL離心管內(nèi)扣緊蓋子用精密天平進(jìn)行稱量，考察1 mL甲醇洗脫體積的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明1 mL甲醇洗脫體積平均值（n=6）為0.790 7 g，RSD值為1.7%，1 mL甲醇理論質(zhì)量為0.79 g，因此可以用1 mL甲醇直接洗脫無(wú)需氮吹復(fù)溶。

2.4 方法線性、檢出限及定量限

表2 外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法定量方法的線性、檢出限和定量限比較Table 2 Comparison of linearity, LOD and LOQ between internal and external calibration methods

采用純甲醇配制ZEN內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照樣品前處理方法對(duì)空白樣品進(jìn)行處理獲得空白基質(zhì)液，采用逐級(jí)稀釋法獲得ZEN的檢出限（RSN≥3）和定量限（RSN≥10）。如表2所示，本研究建立的內(nèi)標(biāo)法定量方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.33 μg/kg，定量限為1 μg/kg，RSD值為4.7%，均優(yōu)于外標(biāo)法定量方法。

2.5 日內(nèi)精密度及回收率

分別采用本研究開(kāi)發(fā)的內(nèi)標(biāo)方法與外標(biāo)方法對(duì)配制的高、中、低3 個(gè)濃度梯度的玉米、小麥。大米、糙米、玉米油加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。本研究開(kāi)發(fā)的內(nèi)標(biāo)定量方法回收率在92.7%～101.3%之間，RSD值在0.02%～3.74%范圍內(nèi)，外標(biāo)法定量方法回收率在54.8%～76.4%之間，RSD值在0.5%～7.0%范圍內(nèi)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在離子化過(guò)程中容易受到基質(zhì)干擾對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)有基質(zhì)增加或者抑制效應(yīng)。外標(biāo)法由于沒(méi)有進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的校正使得基質(zhì)中的ZEN響應(yīng)明顯低于純?nèi)芤簶?biāo)準(zhǔn)品中的響應(yīng)導(dǎo)致回收率偏低。而全碳標(biāo)記的13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)由于和目標(biāo)化合物有相同的保留時(shí)間和離子化效率，因此能夠有效校正基質(zhì)效應(yīng)，達(dá)到提高準(zhǔn)確度和精密度的目的。因此內(nèi)標(biāo)法的回收率明顯優(yōu)于外標(biāo)法。

圖3 不同加標(biāo)水平糧食樣品的回收率Fig. 3 Recoveries of ZEN from different grains at different spike levels

2.6 日間精密度

采用本研究開(kāi)發(fā)的內(nèi)標(biāo)方法對(duì)3 個(gè)樣品連續(xù)4 d進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。本研究開(kāi)發(fā)的內(nèi)標(biāo)定量方法日間精密度（RSD）在0.7%～4.1%范圍內(nèi)，重現(xiàn)性良好。

表3 新方法日間精密度Table 3 Inter-day precision of the new method

2.7 方法的準(zhǔn)確性

表4 新方法對(duì)參考物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Measured values for reference materials obtained by the new method (n= 3)

圖4 玉米樣品中ZEN（A）及13C18-ZEN（B）色譜圖及質(zhì)譜圖（C）Fig. 4 Chromatograms and mass spectra of ZEN and 13C18-ZEN in corn samples

采用本研究開(kāi)發(fā)的內(nèi)標(biāo)方法對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定。如表4所示，所有測(cè)定值均在標(biāo)示值范圍內(nèi)。實(shí)際玉米樣品中的色譜和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，ZEN與13C18-ZEN的保留時(shí)間一致，但是精確相對(duì)分子質(zhì)量又相差18.060 52，表明通過(guò)內(nèi)標(biāo)可以協(xié)助ZEN的定性判定。

3 結(jié) 論

本研究開(kāi)發(fā)的免疫親和柱全自動(dòng)凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-全碳標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法精確測(cè)定糧油中的ZEN方法的檢出限為0.33 μg/kg，定量限為1 μg/kg，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，回收率在92.7%～101.3%，RSD值在0.02%～3.74%，測(cè)定3 種基體質(zhì)控樣品的結(jié)果均在標(biāo)示值范圍內(nèi)，準(zhǔn)確性和精密度明顯優(yōu)于外標(biāo)定量方法。本實(shí)驗(yàn)方法與其他方法[32-34]相比無(wú)需氮吹、可批量自動(dòng)化處理樣品36 個(gè)，實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守，提高工作效率，避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，提高方法精確度；內(nèi)標(biāo)法定量校正加標(biāo)回收率及儀器基質(zhì)效應(yīng)，提高方法準(zhǔn)確性。可用于實(shí)驗(yàn)室能力比對(duì)及標(biāo)物研制過(guò)程中的準(zhǔn)確定值及均一性檢驗(yàn)。