賈 潛，程 超,2，田 成，李 偉，周 志，莫開(kāi)菊,2，汪興平,2,

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000）

糟姜是嫩姜片和紅辣椒丁，配以大蒜、適量食鹽等自然發(fā)酵而成，具有酸、辣、香、脆特點(diǎn)[1]。由于糟姜經(jīng)發(fā)酵形成多種風(fēng)味化合物，食味優(yōu)良，因此深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)發(fā)酵蔬菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究[2-8]，但是糟姜的風(fēng)味相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（head-space solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass specteometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是目前對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析的重要手段[9]。借助于此技術(shù)，Lu Zhenming等[10]對(duì)牛樟芝不同發(fā)酵階段發(fā)酵液中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性和定量分析，Ma Xiaowei等[11]對(duì)中國(guó)37 個(gè)芒果品種的揮發(fā)物組成和含量進(jìn)行分析，Begala等[12]分析了Cannonau 葡萄酒香氣成分，尤其是葡萄酒中萜烯的產(chǎn)生機(jī)理。電子鼻可將揮發(fā)成分的整體信息與數(shù)據(jù)庫(kù)中的信號(hào)作比較，從而綜合判定樣品的氣味[13]。該技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)迅速分析、判別樣品中的氣味差異[14]， 因此電子鼻技術(shù)普遍使用在加工方式對(duì)樣品風(fēng)味的 影響[15]、樣品分類[16-17]、產(chǎn)地鑒別[18]等方面。

風(fēng)味是指導(dǎo)消費(fèi)者購(gòu)買的重要感官指標(biāo)之一，而處理方式對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響一直是關(guān)注的熱點(diǎn)。如謝靚等[19]發(fā)現(xiàn)3 種方式干燥的豆豉味道有差異，自然曬制、烘箱烘干2 種干燥方式處理后豆豉的味道較接近?；酐惗郲20]發(fā)現(xiàn)耐高溫包裝袋烤鰻魚(yú)的品質(zhì)保真效果最好，是烤鰻魚(yú)的最佳包裝袋。常思盎等[21]發(fā)現(xiàn)復(fù)熱工藝能使產(chǎn)品本身的雞肉風(fēng)味有所增強(qiáng)。王歡歡[22]發(fā)現(xiàn)全程維持4 ℃貯藏，隨時(shí)間延長(zhǎng)番茄汁特征性風(fēng)味組分的比例得到了很好的保持。 張靜等[23]發(fā)現(xiàn)電磁加熱處理的肌肉風(fēng)味成分更豐富。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)糟姜貯藏過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律及保真方法的研究相對(duì)較少，而揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律的掌握可在一定程度上指導(dǎo)糟姜的工業(yè)化生產(chǎn)，因此對(duì)糟姜風(fēng)味保真技術(shù)的研究勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)即采用HS-SPME-GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)檢測(cè)6 種處理方法的糟姜的風(fēng)味物質(zhì)，通過(guò)主成分（principal component analysis，PCA）和聚類分析，以確定不同處理方式對(duì)糟姜的風(fēng)味保真效果，旨在為糟姜產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮姜購(gòu)于湖北鳳頭食品有限公司。烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C40）（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；NaCl、無(wú)水Na2SO4（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS、手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 美國(guó)Supelco公司；6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó) Agilent公司；PEN3便攜式電子鼻 德國(guó)Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 糟姜樣品制備

取嫩姜樣品，切片機(jī)切成5 mm左右，添加4%苞谷酒、4%冰糖、6%～7%的食鹽，同時(shí)配以適量紅辣椒丁、花椒、大蒜、25 ℃發(fā)酵1 個(gè)月，然后采用巴氏殺菌、防腐劑處理后真空包裝，并以僅真空包裝樣品為對(duì)照。具體處理方式見(jiàn)表1。

表1 6 種處理方式糟姜樣品編號(hào)Table 1 Six treatments applied to Zaojiang samples

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測(cè)定糟姜的揮發(fā)性成分

萃取條件：將不同處理的糟姜，切碎，磨成漿狀，稱取1 g裝于萃取瓶中，依次加入30% NaCl、2 g無(wú)水Na2SO4，將萃取瓶在45 ℃水浴溫度下平衡12 min，之后在同樣溫度下將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器插入萃取瓶中頂空萃取40 min，最后將纖維頭插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間5 min。重復(fù)測(cè)定3 次。

GC條件：DB-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流量1 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，以5 ℃/min上升至85 ℃，保持1 min；以3 ℃/min上升至165 ℃，保持1 min；以10 ℃/min上升至250 ℃，保持3 min[24]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z33～400。

1.3.3 電子鼻檢測(cè)糟姜的揮發(fā)性成分

PEN3便攜式電子鼻，包含10 個(gè)金屬傳感器陣列（表2）。將不同處理的糟姜磨成漿狀，分別稱取樣品12 g裝入樣品瓶，常溫放置30 min，進(jìn)行測(cè)定。

表2 電子鼻傳感器所對(duì)應(yīng)的香氣類型Table 2 Aroma types corresponding to electronic nose sensors

電子鼻參數(shù)設(shè)置：樣品間隔時(shí)間1 min，自動(dòng)清洗時(shí)間95 s，歸零時(shí)間5 s，插入時(shí)間5 s，測(cè)定時(shí)間90 s，吸氣流量180 mL/min，進(jìn)樣流量180 mL/min。金屬傳感器在60 s后基本穩(wěn)定，選定65、66 s和67 s時(shí)響應(yīng)值，并計(jì)算其平均值[25]，重復(fù)操作5 次。

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)分析

利用GC-MS儀器自帶的分析軟件，對(duì)糟姜樣品采集到的數(shù)據(jù)在NIST 14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中檢索，選擇相似度達(dá)80%以上的成分，并根據(jù)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C40）提供的保留時(shí)間（retention time，RT）計(jì)算保留指數(shù)（retention index，RI），對(duì)鑒定得到的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，通過(guò)各物質(zhì)峰面積估算各物質(zhì)含量，以相對(duì)含量計(jì)[26]。每組樣品測(cè)定3 個(gè)平行，其保留時(shí)間和相對(duì)含量均以平均值計(jì)算。RI公式如下：

式中：n為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx、tn、tn＋1分別為物質(zhì)x和n、n＋1碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Smica14.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和作圖，利用SPSS 22和Origin 2018作聚類分析[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理糟姜的HS-SPME-GC-MS分析

2.1.1 不同處理糟姜風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析

表3 不同處理糟姜的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量Table 3 Contents of volatile components in Zaojing subjected to different treatments

續(xù)表3

續(xù)表3

采用GC-MS測(cè)定6 種處理方式糟姜的風(fēng)味成分，結(jié)果見(jiàn)表3，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分類，結(jié)果見(jiàn) 圖1。由表3可計(jì)算出在6 種處理的糟姜中共鑒定117 種風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)照表3的主要風(fēng)味物質(zhì)，可以看出在烷烴類物質(zhì)（74 種）中主要是萜烯類化合物，而醇類物質(zhì)主要是萜烯醇類（20 種），其他的化合物如羰基化合物7 種、酯類7 種、酸類3 種、酚類2 種、芳香族化合物4 種。不同處理糟姜所含的風(fēng)味物質(zhì)種類不同，P65、P85、SD、SDA、PS、CG分別鑒定出55、60、40、59、62、60 種，其中變化較大的是烷烴類物質(zhì)，SD處理糟姜中顯著下降，僅有26 種。此外不同處理間糟姜所含主要風(fēng)味物質(zhì)種類有差異，P65和P85熱處理，與對(duì)照CG相比，萜烯類物質(zhì)含量和種類增加，同時(shí)萜烯醇類和芳香族化合物含量隨溫度升高大幅度上升，而羰基化合物隨溫度升高顯著下降。相比而言，SD、SDA和PS使用了防腐劑處理的糟姜，萜烯類、萜烯醇類、芳香族化合物、酯類含量變化差異不大。這幾個(gè)處理組檢出的酸類物質(zhì)主要是防腐劑對(duì)應(yīng)的酸。此外在不同處理組中共有風(fēng)味成分含量也有差異，其中變化最顯著的是姜油烯、β-倍半水芹烯、α-姜黃烯，這三類風(fēng)味成分在熱處理組含量明顯高于對(duì)照組。

通過(guò)以上變化可以看出，冷處理組（SD、SDA和PS）對(duì)糟姜的風(fēng)味物質(zhì)含量影響不大，但是P65和P85伴隨著熱處理，萜烯醇類及羰基化合物、芳香族化合物隨著殺菌溫度發(fā)生變化，導(dǎo)致風(fēng)味變化。

2.1.2 不同處理糟姜GC-MS測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)的PCA

由2.1.1節(jié)分析可看出不同處理糟姜的風(fēng)味物質(zhì)種類有變化，進(jìn)一步分析相對(duì)保真效果好的風(fēng)味物質(zhì)，利用PCA對(duì)不同糟姜中的GC-MS測(cè)定的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，提取3 個(gè)PC，PC1方差貢獻(xiàn)率為42.80%，PC2為27.80%，PC3為17.10%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.70%，表明PC1、PC2、PC3的總貢獻(xiàn)率包含了樣品的大部分信息，能代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。PCA的特征向量和載荷矩陣見(jiàn)表4。

表4 PC的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and loading matrix of first three PC

各P C 的載荷值代表該類物質(zhì)在該P(yáng) C 上的反映 程度[28]。相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值越大，PC對(duì)該變量的代表性也越大[29]。羰基化合物和酯類在PC1上載荷值較高，說(shuō)明PC1主要反映羰基化合物和酯類風(fēng)味成分信息，且呈正相關(guān)；醇類和芳香族化合物在PC2上載荷值較高，且呈正相關(guān)；酸類在PC3上載荷值較高，且酸類為風(fēng)味成分的負(fù)向影響因素。

圖2 不同處理糟姜GC-MS測(cè)定風(fēng)味成分的PCA圖Fig. 2 PCA plot of flavor components determined by GC-MS in Zaojiang subjected to different treatments

如圖2所示，沿PC1方向，SDA與CG相距最遠(yuǎn)，即經(jīng)過(guò)雙乙酸鈉處理的糟姜與對(duì)照組香氣成分差異較大；PS與CG相距最近，即經(jīng)過(guò)山梨酸鉀處理的糟姜與對(duì)照組香氣成分差異最小。沿PC2方向，P85與CG糟姜樣相距較遠(yuǎn)，即經(jīng)過(guò)85 ℃巴氏殺菌處理的糟姜與對(duì)照組香氣成分差異較大，沿著PC3方向，P65與CG糟姜樣相距較遠(yuǎn)，即經(jīng)過(guò)65 ℃巴氏殺菌處理的糟姜與對(duì)照組風(fēng)味成分差異較大。但從PC1、PC2、PC3綜合來(lái)看，PS與CG糟姜樣都相距最近，可判斷山梨酸鉀處理組與對(duì)照組兩者整體風(fēng)味相似；SD、SDA與CG較近，P65、P85與CG最遠(yuǎn)；基本上可以劃分為冷處理和熱處理兩類。

2.1.3 不同處理糟姜GC-MS測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析

圖3 不同處理糟姜GC-MS測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of flavor components determined by GC-MS in Zaojiang subjected to different treatments

采用Origin 2018軟件對(duì)GC-MS所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以相關(guān)性為聚類指標(biāo)，相關(guān)性越近的距離越近，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，在歐式距離小于0.001時(shí)，SDA、PS和CG聚為一類，說(shuō)明這三者風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味特征相似度最高，這與GC-MS所測(cè)風(fēng)味物質(zhì)的PCA結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步明確PS、CG、SDA和其他處理組的差異，選取這3 組和與其差異最大的P85處理糟姜進(jìn)行Venn圖分析。由圖4可以看出，這4 種處理組中共有的風(fēng)味物質(zhì)29 種，CG、PS、SDA、P85各單獨(dú)有7、8、4、16 種獨(dú)有的成分，P85處理糟姜獨(dú)有風(fēng)味成分最多，可能是因?yàn)闊崽幚磉^(guò)程中糟姜產(chǎn)生了新的風(fēng)味物質(zhì)。經(jīng)比對(duì)P85處理糟姜中主要特有的風(fēng)味物質(zhì)為γ-姜黃素、氧化芳樟醇（具有強(qiáng)烈的新鮮的甜香、木香和花香）、桉樹(shù)醇、松油醇（萜品醇，具似海桐花的清香，甜的紫丁香、鈴蘭氣息）、4-萜烯醇、(＋)-α-柏木萜烯、γ-去二氫菖蒲烯等，這些風(fēng)味物質(zhì)可能是糟姜熱處理過(guò)程中產(chǎn)生的嗅感成分。

圖4 4 種處理糟姜的GC-MS測(cè)定風(fēng)味成分Venn圖Fig. 4 Venn diagram showing shared and unique flavor components among Zaojiang subjected to different treatments

2.2 不同處理糟姜的電子鼻分析

由于GC-MS可以測(cè)得具體的微觀風(fēng)味物質(zhì)種類和含量，但無(wú)法從宏觀上把握糟姜的整體風(fēng)味，因此利用電子鼻對(duì)不同處理的糟姜進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 電子鼻的傳感器信號(hào)分析

圖5 不同處理糟姜的電子鼻指紋圖Fig. 5 Electronic nose fingerprint of Zaojiang subjected to different treatments

通過(guò)提取各個(gè)傳感器的響應(yīng)值，建立不同處理糟姜的電子鼻指紋圖，如圖5所示。不同處理的糟姜對(duì)10 種傳感器的反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度有差異，其中5 種傳感器（W1C、W3C、W5C、W1W、W2W）響應(yīng)值的差異比較明顯，結(jié)合電子鼻傳感器陣列性能特點(diǎn)[30]，這幾種傳感器均是對(duì)芳香族化合物、萜烯類物質(zhì)比較敏感，由此可見(jiàn)在不同處理組的糟姜中芳香族化合物和萜烯類物質(zhì)含量豐富。

2.2.2 不同處理糟姜的電子鼻PCA

如圖6A所示，不同處理糟姜電子鼻分析共提取了2 個(gè)主成分，PC1方差貢獻(xiàn)率為86.40%，PC2為9.41%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.81%。表明PC1和PC2的總貢獻(xiàn)率幾乎包含了糟姜樣品的所有信息，可以代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)之間無(wú)重疊，說(shuō)明電子鼻可以較好地分辨樣品風(fēng)味。從6 種糟姜在圖6A的分布位點(diǎn)看，即PC1和PC2的綜合距離看，可以認(rèn)為PS與CG距離最近，風(fēng)味特征最相似，SD與SDA、P65與P85相似。若僅以PC2判定，可以將樣品分為熱處理類和冷處理類。另由圖6B可看出，除W2W傳感器與PC2相關(guān)性大外，其他傳感器均與PC1顯著相關(guān)。

圖6 不同處理糟姜的電子鼻PCA圖Fig. 6 PCA plots of electronic nose sensor responses to Zaojiang subjected to different treatments

2.2.3 不同處理糟姜的電子鼻聚類分析

圖7 不同處理糟姜的電子鼻聚類分析圖Fig. 7 Cluster analysis dendrogram of electronic nose sensor responses to Zaojiang subjected to different treatments

采用和GC-MS相同的處理方法對(duì)不同處理糟姜的電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。當(dāng)歐式距離為小于0.002時(shí)，PS、CG聚為一類，歐式距離小于0.004時(shí)，PS、CG和SDA歸為一類，歐式距離小于0.006時(shí)，PS、CG、SDA和P65歸為一類，而P85和SD則與之歐式距離較遠(yuǎn)。再次說(shuō)明PS（山梨酸鉀處理）風(fēng)味最接近CG（對(duì)照）糟姜的固有風(fēng)味，其次是SDA（雙乙酸鈉處理），而同為防腐劑處理的SD（脫氫乙酸鈉處理），則與CG相差較大。同為巴氏殺菌的處理，P65比P85更接近CG。對(duì)比GC-MS的聚類分析結(jié)果可以看出，二者有略微差異，但在聚類歐式距離0.002以內(nèi)，電子鼻和GC-MS的聚類分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

HS-SPME-GC-MS檢測(cè)出6 種處理的糟姜共有117 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要物質(zhì)類別為萜烯類（74 種），其次分別是醇類（20 種）、羰基化合物（7 種）、芳香族化合物（4 種）、酯類（7 種）、酸類（3 種）、酚類（2 種）。

糟姜作為一種民族特色食品，其產(chǎn)品品質(zhì)長(zhǎng)期以來(lái)受到處理方式的困擾，因此本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比熱處理和冷處理兩類方式在糟姜風(fēng)味保真效果的影響。通過(guò)對(duì) HS-SPME-GC-MS和電子鼻測(cè)定結(jié)果進(jìn)行PCA、聚類分析，相對(duì)于對(duì)照組和冷處理組，熱處理糟姜的GC-MS中產(chǎn)生了較多的萜烯、萜烯醇、羰基化合物和較少的芳香族化合物，因此從風(fēng)味上冷處理對(duì)糟姜的保真效果優(yōu)于熱處理。在冷處理中0.1%山梨酸鉀與對(duì)照組糟姜風(fēng)味最為接近，風(fēng)味保真效果最好。此外發(fā)現(xiàn)電子鼻結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)可以全面分析不同處理對(duì)糟姜風(fēng)味的影響，電子鼻宏觀上說(shuō)明了不同處理糟姜的風(fēng)味輪廓的相似性和差異性，而HS-SPME-GC-MS不僅能對(duì)不同保藏方法的糟姜風(fēng)味成分進(jìn)行定性、定量分析，且能從微觀上補(bǔ)充了更為詳細(xì)的風(fēng)味物質(zhì)的具體種類及其異同點(diǎn)。通過(guò)對(duì)2 種測(cè)定方法的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)可以對(duì)不同處理的糟姜進(jìn)行有效且明顯的區(qū)分和歸類，GC-MS和電子鼻具有高度的統(tǒng)一性，可以評(píng)價(jià)糟姜的風(fēng)味保真效果，本研究為糟姜的加工、貯藏和開(kāi)發(fā)利用提供一定的依據(jù)。