曾 橋，呂生華*，李 祥*，胡 歆，梁 艷，樊 成，段 潔，鄧銅玲

（1.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；

3.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；4.咸陽(yáng)涇渭茯茶有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712044；

5.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

茯磚茶為黑茶類緊壓茶，屬于后發(fā)酵茶，加工工藝復(fù)雜，產(chǎn)品形式獨(dú)特，具有內(nèi)質(zhì)金花普茂，開(kāi)湯后湯色紅濃、菌香濃郁、香氣純正、滋味醇厚的品質(zhì)[1]。茯磚茶營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有類黃酮、多糖、多酚、咖啡因、兒茶素、氨基酸、三萜類等多種活性成分，具有抗氧化、減肥、降脂、降壓、降血糖等保健功效[2-7]，近年來(lái)備受消費(fèi)者的親睞。研究發(fā)現(xiàn)原料是影響茯磚茶品質(zhì)的主要因素之一，不同原料活性成分的差異對(duì)茯磚茶感官品質(zhì)和功能均有較大影響[8]。“發(fā)花”是茯磚茶加工過(guò)程中的關(guān)鍵步驟[9]，其實(shí)質(zhì)是在一定的溫度和濕度環(huán)境下，基于開(kāi)放環(huán)境的原料、水和空氣的自然接種進(jìn)行的以冠突散囊菌為主的多菌群協(xié)同作用的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程[10]，通過(guò)“發(fā)花”不僅形成了茯磚茶特有的黑茶花色，還促進(jìn)了茯磚茶內(nèi)部成分的轉(zhuǎn)化，具有比其他黑茶更好的風(fēng)味和功能特性[11]?！鞍l(fā)花”質(zhì)量與茯磚茶的原料、加工環(huán)境和工藝密切相關(guān)，這主要由于這些因素調(diào)控微生物菌群結(jié)構(gòu)及豐度，影響茯磚茶的微生物多樣性，從而影響茯磚茶的品質(zhì)。

鑒于大多數(shù)微生物難以實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，傳統(tǒng)平板分離鑒定微生物的方法具有較大局限性。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性分析，該技術(shù)可檢測(cè)到樣本中傳統(tǒng)純培養(yǎng)不能發(fā)現(xiàn)的低豐度微生物菌群，有助于更加全面準(zhǔn)確地了解微生物組成[12]，在食品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。已有相關(guān)學(xué)者采用高通量測(cè)序技術(shù)分別研究了茯磚茶發(fā)花過(guò)程中真菌群落多樣性的變化[13]，以及不同加工地域?qū)虼u茶微生物多樣性的影響[10]，使得人們對(duì)于茯磚茶中的微生物菌群有更深的了解，但是對(duì)以不同原料加工而成的茯磚茶微生物多樣性的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，開(kāi)展對(duì)不同原料加工的茯磚茶產(chǎn)品中活性成分及微生物多樣性研究，為后續(xù)茯磚茶新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)具有一定的指導(dǎo)意義。本研究以分別由滇紅、安化黑茶、杜仲葉、蒲公英為原料加工而成的茯磚茶產(chǎn)品為對(duì)象，在研究其活性成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)產(chǎn)品中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并對(duì)不同原料加工的茯磚茶產(chǎn)品活性成分與微生物群落相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為不同原料茯磚茶品質(zhì)形成機(jī)制和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶：分別以安化黑茶（湖南安化）、滇紅（云南鳳慶）、蒲公英（山西鄉(xiāng)寧）、杜仲葉（陜西略陽(yáng)）為原料，在同一加工條件下加工制成的茯磚茶。

葡萄糖、蘆丁、咖啡因、茶氨酸、沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公 司； 兒 茶 素（ catechin ， ＋C ） 、 表 兒 茶素（epicatechin，E C）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、乙酸（均為色譜純） 德國(guó)Fisher公司；濃硫酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙二胺四乙酸二鈉、茚三酮（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、堿式乙酸鉛、碳酸鈉、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純） 天津市科密歐 化學(xué)試劑有限公司；苯酚、無(wú)水乙醇、甲醇（均為分 析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

DNA提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司； 瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfu Polymerase 中國(guó)TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen公司；建庫(kù)試劑盒 美國(guó)Bioo Scientific 公司；測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Chromeleon 7.10色譜工作站） 美國(guó)賽默飛世爾公司；TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH5200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波 清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TD5A大容量低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；ELx800 酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；Quantus? Fluorometer微型熒光計(jì) 美國(guó)Promega公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；Illumina Miseq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分檢測(cè)

水浸出物參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》檢測(cè)；總黃酮參照《中國(guó)藥典：一部》山楂葉提取物部分方法檢測(cè)[14]；多糖按文獻(xiàn)[15]方法檢測(cè)；咖啡堿參考 GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》的規(guī)定檢測(cè)；多酚、兒茶素類參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》檢測(cè)；氨基酸參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》檢測(cè)；綠原酸按文獻(xiàn)[16]方法檢測(cè)。

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

樣品D N A 采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒按操作流程進(jìn)行提取， 使用338F （ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)16S rRNA基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行P C R 擴(kuò)增，使用ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）/I T S 2 R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對(duì)ITS rDNA基因的ITS1-ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。

1.3.3 16S rDNA和ITS序列高通量測(cè)序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus? Fluorometer微型熒光計(jì)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料茯磚茶活性成分分析

按照1.3.1節(jié)方法對(duì)分別以安化黑茶、滇紅、蒲公英和杜仲葉為原料加工制作而成的茯磚茶產(chǎn)品中水浸出物、多糖、總黃酮、綠原酸、咖啡因、氨基酸等13 種活性成分進(jìn)行測(cè)定，各不同原料加工所得茯磚茶產(chǎn)品中活性成分含量見(jiàn)表1。

由表1可知，不同原料加工的茯磚茶活性成分差異較大，以安化黑茶為原料加工的茯磚茶中總黃酮、氨基酸、多酚、GA以及兒茶素類成分均較其他茯磚茶含量高。滇紅茯磚茶所含咖啡因含量最高，和其他類茯磚茶相比，氨基酸和多酚含量也較高。蒲公英茯磚茶水浸出物含量最高，兒茶素類成分相較滇紅和杜仲葉茯磚茶高。杜仲葉茯磚茶中多糖和綠原酸含量較其他茯磚茶高，其中多糖含量較其他類型茯磚茶均高97%以上。綠原酸在蒲公英茯磚茶有少量的檢出，在安化黑茶和滇紅茯磚茶中均未檢測(cè)到。此外，蒲公英茯磚茶中未檢測(cè)到＋C，杜仲葉茯磚茶中GA和兒茶素類活性成分含量較低，其中兒茶素類活性成分中EGC、EGCG和ECG未檢出。

表1 不同原料茯磚茶活性成分Table 1 Bioactive components of Fuzhuan tea samples produced from different raw materials

對(duì)各活性成分分析可以發(fā)現(xiàn)：各不同原料加工的茯磚茶中以安化黑茶和杜仲葉為原料加工的茯磚茶水浸出物含量相當(dāng)，二者與滇紅和蒲公英為原料加工的茯磚茶中水浸出物差異極顯著（P＜0.01）；4 種茯磚茶多糖、總黃酮和多酚含量相互差異均極顯著（P＜0.01）；蒲公英茯磚茶和杜仲葉茯磚茶中綠原酸含量差異也達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；以安化黑茶和滇紅為原料加工的茯磚茶咖啡因含量差異較顯著（P＜0.05），二者與蒲公英和杜仲葉含量差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且蒲公英與杜仲葉茯磚茶咖啡因含量差異極顯著 （P＜0.01）；以滇紅和安化黑茶為原料加工的茯磚茶中氨基酸含量相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05），二者與蒲公英和杜仲葉茯磚茶差異極顯著（P＜0.01）；以安化黑茶、滇紅和蒲公英為原料加工的茯磚茶相互間EGC、EGCG、ECG含量差異均極顯著（P＜0.01）；滇紅和蒲公英茯磚茶EC含量差異不顯著（P＞0.05），但二者與安化黑茶和杜仲葉為原料加工的茯磚茶含量差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；杜仲葉和滇紅加工的茯磚茶中＋C含量差異較顯著（P＜0.05），二者與安化黑茶相比差異極顯著（P＜0.01）；以滇紅和蒲公英為原料加工的茯磚茶中GA含量差異顯著 （P＜0.05），二者與安化黑茶和杜仲葉為原料加工的茯磚茶含量差異極顯著（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，所采集的4 種茯磚茶樣品活性成分差異較大，具有一定的代表性。

2.2 不同原料茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同原料茯磚茶真菌群落α多樣性

由表2可以看出，所有測(cè)試的樣本測(cè)序深度均在0.999 8以上，說(shuō)明樣本中未被測(cè)出的序列概率極低，測(cè)序結(jié)果能代表各不同原料加工的茯磚茶樣本中真菌群落的真實(shí)情況[20]。α多樣性指數(shù)結(jié)果表明，各樣本Shannon指數(shù)均極低，而Simpson指數(shù)接近于1，說(shuō)明所有茶樣真菌群落多樣性較低。由ACE指數(shù)和Chao指數(shù)可以看出，所有茶樣真菌群落豐富度也較低。

表2 不同原料茯磚茶真菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Fungal community richness and diversity indexes of Fuzhuan tea samples produced from different raw materials

2.2.2 不同原料茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖1 基于門（A）和屬（B）水平不同原料茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 1 Fungal community structure in Fuzhuan tea produced from different raw materials at phylum (A) and genus (B) levels

圖1 為基于門和屬分類水平的樣本與物種共現(xiàn)性關(guān)系圖，反映了各不同原料茯磚茶中真菌群落結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)，在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）占所有樣本99.99%以上，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，僅有少數(shù)未知分類地位的unclassified_k__Fungi及其他的真菌。從屬分類水平上可以看出，注釋到明確分類地位的有曲霉屬（Aspergillus）和籃狀菌屬（Talaromyces），其他屬豐度較低而統(tǒng)一歸為一類（others），其中Aspergillus在所有樣本中的相對(duì)豐度均在99.99%以上，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。真菌群落α多樣性及結(jié)構(gòu)分析表明，不同原料加工的茯磚茶產(chǎn)品真菌群落多樣性無(wú)明顯差異，可以推斷，影響茯磚茶產(chǎn)品真菌群落多樣性的因素可能為加工工藝和環(huán)境。

2.3 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落α多樣性

表3 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial community richness and diversity indexes of Fuzhuan tea produced from different raw materials

由表3可以看出，所有樣本測(cè)序深度均在0.998 6以上，能夠較好地代表不同原料加工的茯磚茶樣本中細(xì)菌群落的真實(shí)情況。一般情況下，Shannon指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越低，說(shuō)明樣本中細(xì)菌群落多樣性指數(shù) 越高[21]，從表3可以看出，以滇紅為原料加工的茯磚茶產(chǎn)品細(xì)菌群落多樣性高，杜仲葉、蒲公英茯磚茶次之，以安化黑茶為原料加工的茯磚茶細(xì)菌群落多樣性最低。Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映了樣本細(xì)菌群落的豐富度，杜仲葉茯磚茶細(xì)菌群落豐富度最高，其次為以滇紅為原料加工的茯磚茶產(chǎn)品，而以安化黑茶為原料加工的茯磚茶產(chǎn)品細(xì)菌群落豐富度最低，說(shuō)明不同原料加工的茯磚茶產(chǎn)品細(xì)菌的豐度和多樣性存在較大的差異。

2.3.2 OTU聚類分析

圖2 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落OTU的Venn圖Fig. 2 Venn analysis of OTUs in Fuzhuan tea samples produced from different raw materials

對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)一步繪制Venn圖，從而可以直觀反映樣本在不同分類水平上的組成相似性和重疊情況。從圖2可以看出，所有樣本可劃分為906 個(gè)OTU，以安化黑茶、蒲公英、杜仲葉、滇紅4 種原料加工的茯磚茶樣品OTU分別為211、175、571、366 個(gè)。其中，以安化黑茶為原料加工的茯磚茶和蒲公英茯磚茶共有的OTU為71 個(gè)，與杜仲葉茯磚茶共有的OTU為121 個(gè)，與以滇紅為原料加工的茯磚茶共有的OTU為93 個(gè)。蒲公英茯磚茶與杜仲葉茯磚茶共有的OTU為108 個(gè)，與以滇紅為原料加工的茯磚茶共有的OTU為84 個(gè)，而杜仲葉茯磚茶與以滇紅為原料加工的茯磚茶共有的OTU為163 個(gè)。安化黑茶、蒲公英、杜仲葉、滇紅4 種原料分別加工的茯磚茶樣品各自獨(dú)有的OTU分別為74、54、345、185 個(gè)，分別占各自總數(shù)的35.1%、30.9%、60.4%和50.5%，而4 種茯磚茶共有的OTU數(shù)量為54 個(gè)，占所有樣本OTU總數(shù)的6.0%，說(shuō)明不同原料加工的茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

2.3.3 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖3 基于門（A）和屬（B）水平不同原料茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 3 Bacterial community structure in Fu brick tea samples produced from different raw materials at phylum (A) and genus (B) levels

由圖3A可知，在門分類水平上，不同原料加工的茯磚茶共注釋到明確分類地位的有9 個(gè)門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria），其中Proteobacteria在4 種不同原料茯磚茶產(chǎn)品種均為優(yōu)勢(shì)菌。不同茯磚茶產(chǎn)品中微生物在門水平上組成有較大差異，以安化黑茶為原料加工的茯磚茶中Proteobacteria（94.96%）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次為Firmicutes（3.52%）和Actinobacteria（0.84%）；而杜仲葉茯磚茶中相對(duì)豐度由高到低依次為Proteobacteria（78.70%）、Firmicutes（12.08%）、Actinobacteria（2.92%）、Bacteroidetes（1.74%）、Chloroflexi（1.28%）等；以滇紅為原料加工的茯磚茶門水平上的細(xì)菌群落分布與杜仲葉茯磚茶較相似，但各菌群相對(duì)豐度不同，其中Proteobacteria（61.19%）相對(duì)豐度最高，其次為Actinobacteria（18.32%）、Bacteroidetes（8.99%）、Firmicutes（6.20%）；蒲公英茯磚茶中Proteobacteria（71.35%）相對(duì)豐度最高，其次為Bacteroidetes（15.93%）、Actinobacteria（6.15%）、Firmicutes（3.71%）等。

由圖3B可知，在屬水平上注釋到明確分類地位的有30 個(gè)屬，其他相對(duì)豐度較低的合并為一類（others），其中相對(duì)豐度較高的為假單胞菌屬（Pseudomonas）、屬級(jí)分類地位未知的腸桿菌（unclassified_f__Enterobacteriaceae）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、CL500-29_marine_group、黃桿菌屬（Flavobacterium）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等。以安化黑茶為原料加工的茯磚茶中，優(yōu)勢(shì)菌群為unclassified_f__Enterobacteriaceae（42.38%）、Pseudomonas（39.97%），其次相對(duì)豐度較高的為Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（9.49%）、Psychrobacter（1.14%）、漫游球菌屬（Vagococcus，0.89%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，0.88%）和肉桿菌屬（Carnobacterium，0.72%），其他類細(xì)菌屬相對(duì)豐度均低于0.3%。杜仲葉茯磚茶中相對(duì)豐度較高的為Pseudomonas（22.34%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（21.04%），其次為Acinetobacter（11.71%）、Ralstonia（6.90%）、Vagococcus（3.65%）、Psychrobacter（3.64%)、Carnobacterium（2.48%）、棲水菌屬（Enhydrobacter，2.32%）、弧菌屬（Vibrio，1.92%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，1.19%）等。以滇紅為原料加工的茯磚茶中相對(duì)豐度最高的為Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（18.06%），其次為Ralstonia（12.73%）、Pseudomonas（11.98%）、CL500-29_marine_group（11.92%）、Flavobacterium（7.28%）、unclassified_f__Enterobacteriaceae（3.97%）、hgcl_clade（2.02%）、Carnobacterium（1.92%）、Psychrobacter（1.87%）、Stenotrophomonas（1.54%）、分支桿菌屬（Mycobacterium，1.54%）等。蒲公英茯磚茶中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌屬包括Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（17.85%）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium，14.75%）和甲基桿菌屬（Methylobacterium，12.34%），其次為Pseudomonas（8.56%）、norank_f__Mitochondria（8.06%）和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（6.05%）、微桿菌屬（Microbacterium，4.23%）、Ralstonia（4.11%）、Acidovorax（4.04%）等。通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在4 種茯磚茶種均有較高的豐度，而其他類細(xì)菌屬在各不同原料加工的茯磚茶中豐度隨原料的不同而存在明顯的差異。

2.3.4 不同原料加工茯磚茶微生物群落主成分分析

圖4 不同原料加工茯磚茶的主成分分析Fig. 4 PCA of Fuzhuan tea produced from different raw materials

如圖4所示，PC1和PC2主要貢獻(xiàn)之和為87.3%，說(shuō)明該主成分分析圖可以較好地反映各不同原料加工茯磚茶樣之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的影響因素。其中分別以滇紅和杜仲葉為原料加工的茯磚茶距離較近，而以安化黑茶和蒲公英為原料加工的茯磚茶距離較遠(yuǎn)，表明以滇紅和杜仲葉為原料加工的茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似，而與安化黑茶和蒲公英為原料加工的茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，說(shuō)明原料種類對(duì)茯磚茶產(chǎn)品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。

2.4 不同原料茯磚茶細(xì)菌群落組成與活性成分相關(guān)性分析

表4為茯磚茶活性成分與屬水平上相對(duì)豐度較高細(xì)菌群落之間相關(guān)性分析，可以看出，Pseudomonas、Lactobacillus與類黃酮顯著正相關(guān)（P＜0.05），unclassified_f__Enterobacteriaceae與多酚、＋C、EC、EGC和GA顯著正相關(guān)（P＜0.05），Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia與EGCG呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Acinetobacter與多糖呈顯著正相關(guān) （P＜0.05），與綠原酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與氨基酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Psychrobacter與綠原酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與ECG呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Carnobacterium與EC、EGC、ECG均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Enhydrobacter與綠原酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Vibrio與多糖呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與綠原酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與氨基酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），短波單胞菌屬（Brevundimonas）與多糖呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與綠原酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與氨基酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表4 不同原料茯磚茶活性成分與主要細(xì)菌屬相關(guān)性分析Table 4 Pearson’s correlation coefficients between the relative abundances of important genera and bioactive components of Fuzhuan tea samples produced from different raw materials

3 討 論

不同原料茯磚茶真菌群落多樣性分析結(jié)果表明，Aspergillus為所有采集茯磚茶樣品中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，在所有不同原料茯磚茶中的相對(duì)豐度均大于99.99%，這與Li Qin等[5]的研究結(jié)果相似，將茯磚茶的加工過(guò)程分為S1～S10共10 個(gè)階段，并對(duì)每個(gè)階段真菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，Aspergillus在茯磚茶發(fā)酵的各個(gè)階段，其相對(duì)豐度呈先下降后上升的趨勢(shì)，且在S5階段時(shí)，Aspergillus就已經(jīng)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度達(dá)到98%，最終在成品中的相對(duì)豐度達(dá)到99.95%。 趙仁亮等[10]研究了不同地域茯磚茶產(chǎn)品中的真菌群落多樣性，結(jié)果表明，不同地域茯磚茶產(chǎn)品中真菌群落存在一定差異，同時(shí)，所選取的4 個(gè)地域的茯磚茶產(chǎn)品中Aspergillus相對(duì)豐度均在92%以上，除Aspergillus外，還包括屬級(jí)分類地位未知的Trichocomaceae-unclassified、Eurotiomycetes-unclassified、Eurotiales-unclassified、Ascomycota-unclassified、Candida、Wallernia等，真菌中Aspergillus相對(duì)豐度低于本研究所采集的樣本。對(duì)上述結(jié)果共同分析可以發(fā)現(xiàn)，茯磚茶中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異主要和加工工藝以及加工環(huán)境有關(guān)，原料對(duì)于茯磚茶產(chǎn)品中真菌群落多樣性影響不大。冠突散嚢菌屬于散囊菌目發(fā)菌科Aspergillus屬，是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，其數(shù)量是評(píng)價(jià)茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[22-23]，GB/T 9833.3—2013《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》規(guī)定冠突散囊菌數(shù)量應(yīng)大于20×104CFU/g，本研究所采集的樣本Aspergillus相對(duì)豐度高，一定程度上反映了本產(chǎn)品質(zhì)量較好，說(shuō)明高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于茯磚茶質(zhì)量評(píng)價(jià)具有較好的可行性和實(shí)際意義。目前，由于二代測(cè)序讀長(zhǎng)較短[24]，因此一般注釋到屬水平相對(duì)準(zhǔn)確，而在種水平上的分類學(xué)信息置信度較低，后續(xù)研究中可考慮結(jié)合第三代測(cè)序技術(shù)[25]對(duì)茯磚茶中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從而在種水平上反映茯磚茶中真菌群落組成，有助于更加科學(xué)地對(duì)茯磚茶質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，近年來(lái)，對(duì)于茯磚茶中微生物群落組成的研究主要集中于以冠突散囊菌等為主的真菌，而對(duì)于茯磚茶中細(xì)菌群落組成的研究較少。研究表明，細(xì)菌是茯磚茶中重要的菌群，劉石泉等[26]采用變性梯度凝膠電泳法對(duì)茯磚茶發(fā)花過(guò)程中細(xì)菌群落變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，茯磚茶中細(xì)菌種類較為豐富，在發(fā)花早期，由于冠突撒囊菌的生長(zhǎng)，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到一定抑制，而在發(fā)花后期細(xì)菌總數(shù)量呈上升趨勢(shì)，與冠突散囊菌保持共生關(guān)系。趙仁亮等[9]對(duì)不同地域茯磚茶產(chǎn)品中的細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地域茯磚茶細(xì)菌群落多樣性存在一定的差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同原料加工的茯磚茶中細(xì)菌群落多樣性的研究結(jié)果表明，在門分類水平上，4 種茯磚茶檢測(cè)到3 個(gè)豐度較高的相同的門，分別是Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，而分別以滇紅、杜仲葉和蒲公英為原料加工的3 種茯磚茶還檢測(cè)到相同的Bacteroidetes，但各不同門水平的細(xì)菌豐度有較大差異，Proteobacteria在以安化黑茶為原料加工的茯磚茶中豐度為94.96%，為所有樣本中最高；Firmicutes在杜仲葉茯磚茶中相對(duì)豐度最高，達(dá)12.08%；Actinobacteria在以滇紅為原料加工的茯磚茶中相對(duì)豐度最高，達(dá)18.32%；而B(niǎo)acteroidetes在蒲公英茯磚茶中相對(duì)豐度為最高，達(dá)15.93%。在屬水平上，4 種茯磚茶中檢測(cè)到2 個(gè)相對(duì)豐度較高的相同的屬，分別是Pseudomonas和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，其中Pseudomonas在以安化黑茶為原料加工的茯磚茶中相對(duì)豐度最高，達(dá)39.97%，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在杜仲葉茯磚茶中相對(duì)豐度最高，為21.04%。以安化黑茶、杜仲葉和滇紅為原料加工的3 種茯磚茶中檢測(cè)到2 個(gè)共同的屬，分別是Psychrobacter和Carnobacterium，二者均在杜仲葉茯磚茶中相對(duì)豐度最高，分別為3.64%和2.48%。Ralstonia在以杜仲葉、滇紅和蒲公英為原料加工的茯磚茶中均被檢測(cè)到，且在滇紅為原料加工的茯磚茶中相對(duì)豐度最高，為12.73%。茯磚茶中含有的Pseudomonas、Vibrio、Brevundimonas等通常被認(rèn)為屬于條件致病菌，劉石泉[26]、趙仁亮[9]等也在茯磚茶中發(fā)現(xiàn)了類似菌，此外，姚靜等[27]在普洱茶中分離出了Pseudomonas，上述致病菌中Pseudomonas在各種不同原料茯磚茶中均有較高豐度，這些細(xì)菌在茯磚茶中的作用和安全性還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，不同原料茯磚茶中真菌群落結(jié)構(gòu)差異不大，而細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，茯磚茶中部分活性成分如多糖、黃酮、綠原酸等和一些細(xì)菌屬豐度的相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著水平。有研究表明，茯磚茶原料活性成分和微生物代謝過(guò)程有較密切的關(guān)系，發(fā)花過(guò)程中多糖[15]、 總黃酮[28]、綠原酸[16]、氨基酸[29]、EGC、EGCG、多酚等活性成分存在一定程度的下降，這是由于微生物代謝的結(jié)果，普洱茶中也存在類似的現(xiàn)象，微生物代謝所分泌的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等對(duì)主要代謝產(chǎn)物具有催化作用[5,30]，因此，在后續(xù)研究中有必要進(jìn)一步對(duì)各種不同原料茯磚茶發(fā)花過(guò)程中活性成分和微生物多樣性進(jìn)行研究，明確不同原料茯磚茶發(fā)花過(guò)程中微生物代謝機(jī)制，從而為采用不同原料在加工茯磚茶時(shí)針對(duì)原料特點(diǎn)更好的進(jìn)行人工調(diào)控提供依據(jù)，最終達(dá)到提高茯磚茶品質(zhì)的目的。