艾克熱木·吐爾遜

心肌細(xì)胞凋亡、損傷是引起心血管功能異常及相關(guān)疾病的重要始動(dòng)因素之一，其與心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病關(guān)系密切[1]。Twinfilin-1(Twf-1)基因是一類細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)彈性纖維的長度與排列[2]。在心肌細(xì)胞中，細(xì)胞骨架不僅參與維持細(xì)胞形態(tài)，為細(xì)胞中細(xì)胞器的定位提供支持，并且參與細(xì)胞蛋白合成以及營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[3-4]。目前研究表明細(xì)胞骨架在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚等心血管疾病過程中發(fā)揮了重要作用。探討心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)及其對心肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，對于明確心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制具有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 H9C2心肌細(xì)胞購于ATCC(American type culture collection)。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(GIBCO公司)，TRIZOL、轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)體LTX、PI(Invitrogen公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液(Sigma公司)，SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司)，CCK8試劑盒(同仁)。Twf-1 RNAi慢病毒、pCXN2-Flag空質(zhì)粒及 pCXN2-Flag-h Twf-1 過表達(dá)質(zhì)粒均由深圳華大基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9C2 細(xì)胞置于含10%胎牛血清FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于5%二氧化碳、37 ℃條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔約×105個(gè)細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，分別進(jìn)行空白對照試劑、陰性慢病毒試劑以及Twf-1 RNAi慢病毒試劑感染。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并加入嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選。待熒光顯微鏡下觀察見含綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞占細(xì)胞總量的80%以上時(shí)，將轉(zhuǎn)染Twf-1 RNAi慢病毒的心肌細(xì)胞分為3組，分別給予空白試劑、空質(zhì)粒、過表達(dá)Twf-1質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況分為空白對照組、陰性對照組、Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組、Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組 5組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后即可進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為能力檢測。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn) H9C2細(xì)胞總RNA提取按照RNAprepPureMicroKit說明操作，細(xì)胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明進(jìn)行RT -PCR檢測，反應(yīng)程序：95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用相對定量分析按照2-△△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△△CT(對照組)求出 Twf-1 表達(dá)水平。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8) 收集各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3 000個(gè)，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，于72 h向每孔加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)箱中放置2 h，隨后用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(流式細(xì)胞術(shù)) 分組干預(yù)72 h后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15 mL的錐形管中并置于冰上。用2 mL PBS 溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，去除PBS溶液，加0.5 mL 0.25%不含EDTA胰酶孵育，直到顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始從培養(yǎng)板壁脫落。輕輕連續(xù)拍打使細(xì)胞從培養(yǎng)板壁上完全脫落，將細(xì)胞輕輕重懸于預(yù)冷緩沖液中制成1×106/mL細(xì)胞懸液，取0.5 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至干凈離心管內(nèi)，加入1.25 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑 Annexin V-FITC。室溫避光反應(yīng)15 min后離心，去除上清，將細(xì)胞用0.5 mL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液輕懸，加入10 μL PI，立即使用流式細(xì)胞儀檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 H9C2心肌細(xì)胞慢病毒感染情況 對慢病毒載體進(jìn)行熒光蛋白和嘌呤霉素雙標(biāo)記，慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下可見，空白對照組無綠色熒光標(biāo)記，陰性對照組80%以上細(xì)胞有綠色熒光標(biāo)記，Twf-1沉默組85%以上細(xì)胞有綠色熒光標(biāo)記。詳見圖1。

圖1 H9C2心肌細(xì)胞慢病毒感染情況(×100)

2.2 各組心肌細(xì)胞Twf-1基因表達(dá)水平比較 RT-PCR結(jié)果顯示，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染后，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)水平則明顯增加，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.3 各組心肌細(xì)胞增殖情況比較 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染慢病毒后，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組心肌細(xì)胞增殖效率均明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組心肌細(xì)胞增殖效率則明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡率情況比較 流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組心肌細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組心肌細(xì)胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組相比則明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05；與Twf-1沉默組比較， △P<0.05；與Twf-1沉默+空質(zhì)粒組比較，☆P<0.05。

圖5 各組心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡是引起各種慢性心力衰竭、心臟功能惡化的主要因素之一，心肌細(xì)胞凋亡是貫穿整個(gè)心血管疾病發(fā)病過程的重要環(huán)節(jié)，尋找抑制心肌細(xì)胞凋亡的途徑及相關(guān)分子作用機(jī)制至關(guān)重要[5]。

Twf-1基因?qū)儆诩?dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族成員之一，在除植物細(xì)胞以外的所有真核細(xì)胞中普遍存在[6]。Twf-1基因主要參與細(xì)胞骨架的重塑，在肌動(dòng)蛋白纖維的極向生長中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用[7]。作為一個(gè)重要的骨架調(diào)節(jié)蛋白，Twf-1基因不僅與心肌細(xì)胞遷移、增殖等動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)有關(guān)，還與某些細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成以及細(xì)胞凋亡等生理病理過程有關(guān)。研究指出，Twf-1基因可與某些肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合，通過與加帽蛋白的相互作用，參與profilin蛋白的腺苷酸化及聚合反應(yīng)，由此參與完成肌動(dòng)蛋白纖維的極向生長[8-9]。研究指出，在細(xì)胞骨架重塑過程中，Twf-1基因主要參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白單體的動(dòng)態(tài)循環(huán)[6，10]?，F(xiàn)已有研究明確指出，Twf-1基因與心肌肥大病理生理過程密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚未完全明確[11-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，采用siRNA干擾技術(shù)沉默Twf-1基因的表達(dá)可明顯抑制肌動(dòng)蛋白纖維絲的形成，從而減弱腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移的能力，降低瘤細(xì)胞的侵襲性，提示Twf-1基因在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[13-14]。

本研究利用siRNA干擾技術(shù)，對H9C2心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)水平進(jìn)行了下調(diào)，并通過構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒對H9C2心肌細(xì)胞中Twf-1基因進(jìn)行過表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組心肌細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，這兩組心肌細(xì)胞凋亡率則明顯增加(P<0.05)。且與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組心肌細(xì)胞中Twf-1基因的表達(dá)水平及細(xì)胞增殖率也均明顯增加(P<0.05)，其心肌細(xì)胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Twf-1沉默+過表達(dá)Twf-1組心肌細(xì)胞與Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質(zhì)粒組相比其凋亡率則明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示siRNA可靶向沉默Twf-1基因，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，構(gòu)建pCXN2-Flag-h Twf-1 過表達(dá)質(zhì)粒則可逆轉(zhuǎn)Twf-1 siRNA對心肌細(xì)胞中Twf-1表達(dá)水平及相關(guān)生物學(xué)行為能力的影響。

綜上所述，沉默Twf-1基因可抑制H9C2心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過表達(dá)Twf-1基因則可促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探究Twf-1具體的上下游靶基因，對心血管疾病潛在治療靶點(diǎn)Twf-1的具體作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。