何德全，陳友權(quán)

動脈粥樣硬化(AS)在我國中老年居民中呈高發(fā)態(tài)勢，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，威脅病人生命健康[1]。AS發(fā)病緩慢且病因復(fù)雜，與脂質(zhì)浸潤、血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、炎性細(xì)胞浸潤、血栓形成等多種因素密切相關(guān)[2]。AS不僅僅是動脈壁脂質(zhì)堆積，它更是病理狀態(tài)下的固有免疫和適應(yīng)性免疫介導(dǎo)的慢性炎性疾病[3]。白三烯(1eukotriene， LTs)是一種重要的炎癥介質(zhì)，它是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物[4]，5-脂氧酶 (5-LO)是催化花生四烯酸(AA)轉(zhuǎn)化成白三烯的關(guān)鍵酶[5]。目前國外已有研究表明，白三烯在動脈粥樣斑塊組織、晚期斑塊和軟斑塊處表達(dá)異常豐富，說明白三烯與AS關(guān)系密切，而國內(nèi)則較少涉及此類研究。丹參酮ⅡA磺酸鈉是從植物丹參中分離的二萜醌類化合物丹參酮ⅡA， 經(jīng)磺化而得到的水溶性物質(zhì)，具有抗血小板聚集、抗自由基損害等作用[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究表明，丹參酮ⅡA具有抗心肌缺血、抗AS、增加冠狀動脈血流量、抗心律失常、抗菌、抗炎和抗腫瘤等作用[7]。本實驗擬通過建立大鼠AS模型，證實5-LO/白三烯在AS中的異常表達(dá)，由此探討丹參酮ⅡA通過5-LO/白三烯通路對AS的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 體質(zhì)量180～220 g的SD大鼠45只，購自中國科學(xué)院上海斯萊克實驗動物有限公司。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購于美國BOSTER公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自TakaRa公司。5-LO、白三烯A4H(LTA4H)、白三烯B4(LTB4)和GAPDH抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜購自Millipore公司。蘇木精-伊紅(HE)試劑盒和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模與分組 將45只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成對照組、AS模型組和丹參酮ⅡA組，每組15只。除對照組外，AS模型組和丹參酮ⅡA組大鼠均通過喂養(yǎng)高脂膽固醇(1.25%膽固醇和21%脂肪)飼料結(jié)合腹腔注射維生素D3的方法建立大鼠AS模型，共12周。同時丹參酮ⅡA組大鼠按照100 mg/(kg·d) 劑量在造模過程中同步連續(xù)灌胃給藥12周，對照組和AS模型組則同步給予等體積生理鹽水。

1.2.2 HE染色觀察腹主動脈內(nèi)膜病理表現(xiàn)情況 12周末，隨機(jī)選取5只大鼠，予25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后快速分離腹主動脈，取1 cm長腹主動脈，生理鹽水沖洗后置于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)HE染色觀察病理表現(xiàn)。剩余血管置入凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測血清中血脂含量變化 12周末，隨機(jī)選取5只大鼠，予25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后于心尖部采血，1 500 r/min離心，10 min后取血清，通過全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.2.4 ELISA檢測5-LO、LTB4和白三烯C4(LTC4)和LTA4H含量變化 12周末，隨機(jī)選取5只大鼠，予25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后于心尖部采血置促凝管中，待凝固后以3 000 r/min離心15 min，分離血清于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒測定各組大鼠所采集血清中5-LO、LTB4和LTC4含量。

1.2.5 免疫組化法測定腹主動脈中5-LO陽性表達(dá)情況 腹主動脈經(jīng)固定、包埋、石蠟切片、脫水、緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20 min，滴加一抗，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，滴加二抗，沖洗后加ABC復(fù)合物，DAB顯色，在400倍顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測 使用TRIzol試劑提取大鼠主動脈總RNA，用Nanodrop 2000 儀器檢測樣品RNA濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說明書配置相應(yīng)的體系，每組設(shè)置3個復(fù)孔。使用TB GreenTM Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行qPCR。qPCR的條件如下：95 ℃ 30 s (1循環(huán))，95 ℃5 s、60 ℃30 s(40循環(huán))。使用StepOnePlus 儀器完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。實驗獨立重復(fù)3次。其中使用的引物見表1。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測 取大鼠腹主動脈組織(100 mg)樣本加入1 mL制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的5-LO、LTB4、LTA4H和GAPDH一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入對應(yīng)于一抗種屬來源的HRP標(biāo)記的二抗，在室溫?fù)u床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腹主動脈組織結(jié)構(gòu)改變分析 與對照組比較，AS模型組大鼠腹主動脈內(nèi)皮細(xì)胞破壞，出現(xiàn)明顯的鈣化及炎細(xì)胞浸潤，平滑肌細(xì)胞增殖、萎縮，彈力纖維斷裂，為典型AS病理變化，表明AS造模成功。詳見圖1。

圖1 HE染色觀察對照組與AS模型組大鼠腹主動脈的組織結(jié)構(gòu) (×200)

2.2 丹參酮ⅡA對大鼠血清中TC、TG、LDL和HDL含量的影響 與對照組比較，AS模型組大鼠血液中TC、TG和LDL含量均增加(P<0.05)，HDL含量增加(P<0.05)；與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠血液中TC、TG和LDL含量均減少(P<0.05)，HDL含量減少(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠血清中TC、TG、LDL和HDL的含量變化 (±s) 單位： mmol/L

2.3 丹參酮ⅡA對大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量的影響 與對照組比較，AS模型組大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均增加(P<0.05)；與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均減少(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4的含量變化 (±s) 單位： ng/L

2.4 丹參酮ⅡA對大鼠主動脈中5-LO、LTA4H和LTB4蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，AS模型組大鼠主動脈中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠主動脈中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

與對照組比較，＊P<0.05；與AS模型組比較，#P<0.05。

與對照組比較，＊P<0.05；與AS模型組比較，#P<0.05。

2.5 丹參酮ⅡA對大鼠腹主動脈中5-LO陽性表達(dá)的影響 對照組動脈管壁均勻，為淡藍(lán)色淺染；AS模型組動脈管壁周圍棕黃色深染；丹參酮ⅡA組管壁內(nèi)膜脂質(zhì)浸潤較AS模型組輕。詳見圖4。

圖4 免疫組化法測定大鼠主動脈中5-LO陽性表達(dá)情況(×400)

3 討 論

AS指在動脈及其分支血管壁內(nèi)膜發(fā)生脂質(zhì)沉積，且平滑肌細(xì)胞大量增殖并向內(nèi)膜遷移，從而導(dǎo)致內(nèi)膜增厚并最終形成粥樣病灶[8]。AS是一個復(fù)雜的病理過程，發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。目前，越來越多的證據(jù)表明，AS是一種炎癥和免疫性疾病。

白三烯是一種強(qiáng)烈的脂質(zhì)促炎因子，其產(chǎn)物L(fēng)TB4是體內(nèi)重要的炎癥介質(zhì)，LTB4可刺激多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其產(chǎn)生主要受5-LO和LTA4H的影響[10]。5-LO是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，廣泛分布于機(jī)體內(nèi)，靜息狀態(tài)下5-LO主要分布在細(xì)胞質(zhì)和核漿中，不合成白三烯[11]；當(dāng)受到病理刺激時，5-LO催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化成生成LTA4，LTA4被LTA4H進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為LTB4或者經(jīng)相關(guān)酶生成LTC4[12]。馬海英等[13]研究表明：白三烯在哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時白三烯參與了AS血管重塑，是動脈硬化的機(jī)制之一。

丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性松香烷型二萜類化合物，是丹參根部的主要提取物，具有抗癌、抗菌、抗病毒等臨床藥理作用，受到醫(yī)藥學(xué)家的高度關(guān)注[14]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能顯著降低AS小鼠血清TG、TC、LDL濃度，表現(xiàn)出明顯的抗AS作用[15]。因此，丹參酮ⅡA在抗AS方面發(fā)揮著重要作用。

本實驗結(jié)果表明，與對照組比較，AS模型組大鼠腹主動脈出現(xiàn)明顯的AS病理變化，表明AS造模成功。與對照組比較，AS模型組大鼠血液中TC、TG和LDL含量均增加(P<0.05)，HDL含量減少(P<0.05)，與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠血液中TC、TG和LDL含量均減少(P<0.05)，HDL含量增加(P<0.05)，表明丹參酮ⅡA能降低AS模型組大鼠的血脂含量，減輕AS的病理癥狀。與對照組比較，AS模型組大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均增加(P<0.01)，與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均減少(P<0.05)；與對照組比較，AS模型組大鼠主動脈中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，與AS模型組比較，丹參酮ⅡA組大鼠主動脈中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)；對照組動脈管壁均勻，為淡藍(lán)色淺染，AS模型組動脈管壁周圍棕黃色深染，丹參酮

ⅡA組管壁內(nèi)膜脂質(zhì)浸潤較AS模型組輕，以上實驗結(jié)果表明，丹參酮ⅡA能抑制5-LO/白三烯通路的活性，對AS有治療作用。

綜上所述，5-LO/白三烯與AS關(guān)系密切，其有可能是潛在的藥物治療AS的重要干預(yù)靶點，以抑制這一通路為目標(biāo)將有望研制出療效更加顯著的治療AS的藥物。