鮑瑤菲，薛茜茹，武海萍，鄒秉杰，宋沁馨*，周國華，3

（1中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實驗室，南京210009；2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，南京210002；3南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州510515）

自新型冠狀病毒首次出現(xiàn)以來，在全世界范圍內(nèi)快速傳播，現(xiàn)已至全球大流行，截至2020 年9月30 日全球感染人數(shù)已達(dá)3 300 萬人，造成100 多萬人死亡，且確診人數(shù)和死亡人數(shù)還在持續(xù)增加，給全球經(jīng)濟(jì)和公眾健康都造成了嚴(yán)重的威脅。國際病毒分類委員會將這種新的冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），SARS-CoV-2 是一種單鏈正股RNA病毒，目前用于檢測SARS-CoV-2 的基因靶標(biāo)有核衣殼（N）、包膜（E）、刺突（S）、RNA 依賴性RNA 聚合酶（RdRP）和開放閱讀框架1ab（ORF1ab）基因等［1］。

基于核酸的檢測方法具有高靈敏度和低假陰性率的優(yōu)勢，相對其他檢測方法（如抗體檢測）更靈敏、特異性更好，目前各國檢測新冠病毒最普遍方法為對口咽或鼻咽拭子進(jìn)行基于實驗室的病毒RNA 的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR），這已成為用于確診新冠感染的金標(biāo)準(zhǔn)，被中國國家衛(wèi)建委、WHO等作為新冠確診的重要依據(jù)。但這種方式普遍檢測時間長（約1.5～2 h），需要昂貴的大型儀器、專門的試劑、專業(yè)的操作人員以及在完備的符合生物安全條件的標(biāo)準(zhǔn)實驗室中才能進(jìn)行，并不適合及時檢測，這就導(dǎo)致無法在第一時間對疑似病例進(jìn)行及時快速的檢測，遲滯疫情防控工作的進(jìn)行，對公共安全造成潛在影響。因此急需能夠在資源有限的情況下實現(xiàn)快速便捷檢測新冠病毒的方法以及時控制疫情，即時檢測（point-of-care testing，POCT）［2］又稱床旁檢測就成為了對標(biāo)準(zhǔn)實驗室檢測流程很好的補(bǔ)充，它是指在采樣現(xiàn)場進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到結(jié)果的一種檢測方式。即時檢測不僅適用于臨床實驗室，還可以由受過簡單訓(xùn)練的非實驗室人員在樣品采集現(xiàn)場（例如床旁，醫(yī)生辦公室或急診室）中進(jìn)行。此外，即時檢測只需要很少的操作步驟，通常無需培訓(xùn)或只需要進(jìn)行簡單培訓(xùn)即可熟練掌握，結(jié)果易于讀取，具有準(zhǔn)確、快速、便攜、簡便和低成本的優(yōu)勢，有利于更快的臨床決策并從專業(yè)檢測實驗室分擔(dān)工作負(fù)荷，加快篩查速度、控制疫情。

本文主要從提取、核酸擴(kuò)增、檢測和商業(yè)一體化即時檢測方法4 個方面總結(jié)了目前已有的針對新冠病毒開發(fā)的即時檢測方法及其原理，以期為檢測能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時篩查提供參考，合理利用即時檢測可以分擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)實驗室的負(fù)擔(dān)，提高各國對疫情快速篩查、及時防控的能力。

1 樣本提取

新冠檢測可用的樣本類型包括肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、痰液樣本等，其中最常用為鼻咽拭子，但鼻咽拭子的采集需要專業(yè)醫(yī)護(hù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范操作，采集過程中受試者會有不適感且對于醫(yī)護(hù)人員來說有暴露風(fēng)險。因此選擇一種采集更便捷的樣本類型將更適合即時檢測。早先已有研究發(fā)現(xiàn)在唾液中可以檢出新冠病毒［3］，唾液樣品收集快速、無創(chuàng)，價格低廉并且易于存儲，還可以避免收集鼻咽拭子樣本的風(fēng)險，對患者和醫(yī)療保健提供者而言更加安全，并且唾液樣本采集方便不需要熟練的技術(shù)人員，適合非實驗室環(huán)境甚至居家檢測。Lamb 等［4］設(shè)計針對開放閱讀框ORF1ab 的NSP3 編碼區(qū)的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP），在30～45 min 內(nèi)完成模擬患者唾液樣品中特異性檢測SARS-CoV-2，與RT-PCR 陽性一致率為95%（N = 19/20）。SalivaDirect 方法［5］也采用唾液作為檢測樣本，將核酸提取步驟替換成簡單的蛋白酶K 和熱處理步驟，與基于鼻咽拭子純化提取的常規(guī)RT-PCR 方法相比相關(guān)性達(dá)94%，且該檢測流程能與多種RT-PCR 試劑盒兼容，極大縮短了檢測時間。

此外，RUCDR Infinite Biologics 開發(fā)的新唾液收集方法將比目前的鼻咽拭子方法更適合進(jìn)行廣泛的人群篩查，提供了一種方便的樣品收集方法來開發(fā)價格適宜的即時護(hù)理測試套件，F(xiàn)DA 已為該方法授予了緊急使用授權(quán)（EUA）［6］。唾液作為一種樣本收集方法，對COVID-19患者SARS-CoV-2的檢測具有良好的準(zhǔn)確性，有替代鼻咽拭子用作SARS-CoV-2 的即時檢測樣本的潛力［3］，但唾液中病毒載量在癥狀出現(xiàn)的第1周最高，隨后會隨時間下降［7］，與鼻咽拭子相比靈敏度有所下降。

目前手動RNA 提取限制了新冠即時檢測的開發(fā)和應(yīng)用，常規(guī)的RNA 提取意味著更長的周轉(zhuǎn)時間，更多的人力、試劑的成本，以及處理臨床標(biāo)本時交叉污染和生物安全的風(fēng)險。為了優(yōu)化提取步驟，Zhao等［8］利用基于帶有羧基涂層的聚氨基酯磁性納米顆粒（pcMNPs）在20 min內(nèi)從多個樣品中進(jìn)行病毒RNA 提取，該方法將裂解和結(jié)合合并為一個步驟，并且pcMNPs-RNA 復(fù)合物可以直接引入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)中。

除了新的提取方法外，免提取方法的開發(fā)也是一種解決思路。Wee 等［9］提出了一種稱為直接快速免提取PCR（DIRECT-PCR）的方法，使用抗抑制劑的酶和試劑來免除RNA 提取步驟，可在36 min 內(nèi)在市售便攜式PCR 熱循環(huán)儀上完成快速直接PCR 檢測，針對呼吸道樣品中的病毒核衣殼（N）基因每個反應(yīng)最低可檢測到6 個拷貝，減少了實驗室人員的操作時間和生物安全風(fēng)險且具有便攜性，可在分子生物學(xué)實驗室之外進(jìn)行。在基于等溫擴(kuò)增原理開發(fā)的方法中發(fā)現(xiàn)，病毒運(yùn)輸介質(zhì)可能包含一種或多種抑制劑，將鼻咽拭子直接置于病毒運(yùn)輸介質(zhì)中不進(jìn)行RNA 分離步驟直接進(jìn)行RT-LAMP，會使RT-LAMP 的有效性降低［4］。Wei等［10］開發(fā)了一種直接在鼻咽拭子后的病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)上檢測的方法，無需事先提取RNA，敏感性為85%，可以兼容不同制造商的試劑探針。雖然病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)仍會使檢測靈敏度有所降低，但可以簡化工作流程，縮短周轉(zhuǎn)時間，更適合即時檢測。此外，超高靈敏度的檢測方法也可無需進(jìn)行額外的樣品處理或RNA純化［11］。

2 核酸擴(kuò)增

2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

RT-PCR 是目前檢測新冠病毒核酸最普遍的方法，利用該原理開發(fā)的試劑盒數(shù)量占比也是最多的。RT-PCR 的原理為利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 轉(zhuǎn)換為與其互補(bǔ)的cDNA，隨后cDNA 的特定區(qū)域經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過程中或終點(diǎn)處讀取熒光信號以實現(xiàn)檢測。

基于實驗室的RT-PCR 應(yīng)用于即時檢測的主要障礙包括：實時熒光檢測儀通常體積較大、操作復(fù)雜需要專業(yè)人員、周轉(zhuǎn)時間長等。這些在即時檢測上的局限性促使研究人員探索在保持常規(guī)RT-PCR 的靈敏度和特異性的同時簡化和縮短流程的方法。在RT-PCR 的樣品擴(kuò)增階段，需要熱循環(huán)儀來實現(xiàn)溫度的程序變化，但熱循環(huán)儀成本較高，在資源缺乏地區(qū)難以大量配備。Arumugam等［12］開發(fā)了一種水浴加熱儀器替代PCR 循環(huán)儀，包含兩個水浴：一個用于變性，另一個用于逆轉(zhuǎn)錄，然后使用電機(jī)操作臂將PCR 管穿梭在兩個水浴之間進(jìn)行退火延伸步驟，這臺設(shè)備造價便宜，可實現(xiàn)96 個樣本同時處理，若使用薄膜PCR 反應(yīng)管可在12 min 內(nèi)完成反應(yīng)，與臺式PCR 儀相比速度明顯提升，適合在欠發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用。

2.2 等溫擴(kuò)增

核酸等溫擴(kuò)增無需進(jìn)行熱循環(huán)步驟，可以在恒定溫度下快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是RT-PCR 最有潛力的替代方法，能實現(xiàn)與RT-PCR 相似水平的病毒RNA 檢測且更加適合應(yīng)用于即時檢測。目前用于即時檢測的常用的等溫擴(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和Nicking酶輔助反應(yīng)（NEAR）技術(shù)。

2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP） RTLAMP 原理見圖1，首先將SARS-CoV-2 的RNA 基因組逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再設(shè)計4 個能與靶基因組上6 個不同區(qū)域結(jié)合的特殊設(shè)計的引物，使用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶替代熱變性生成單鏈模板，在四引物系統(tǒng)中，有兩個內(nèi)部引物和兩個外部引物。正向內(nèi)部引物的3′末端引發(fā)了初始DNA鏈的合成，隨后被正向外部引物引發(fā)的合成所取代。正向內(nèi)部引物的5′末端的反向互補(bǔ)序列與置換的ssDNA 鏈中的下游序列退火，形成一個環(huán)。然后在每個末端環(huán)上的ssDNA 充當(dāng)LAMP 擴(kuò)增循環(huán)的起始，使目標(biāo)序列被指數(shù)擴(kuò)增。LAMP 具有很高的特異性和敏感性，操作簡單，在60～65 ℃的恒溫下不到1 h 即可完成，避免了使用熱循環(huán)儀的麻煩，并且由于使用了更多的引物因此具有很高的特異性?？梢酝ㄟ^添加pH 敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等進(jìn)行可視化檢測。

圖1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）原理示意圖

Yu等［13］開發(fā)了名為iLACO的資源缺乏地區(qū)即時檢測方案，以O(shè)RF1ab 的片段作為靶標(biāo)，在65 ℃的水浴中溫育，每毫升1 000 個拷貝的濃度可以在20 min的反應(yīng)時間內(nèi)得出結(jié)果，但還不足以進(jìn)行低病毒載量樣本的靈敏篩查。為了實現(xiàn)更高的靈敏度和特異性，Yang等［14］對不同靶標(biāo)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)ORF1ab 基因具有很高的特異性但靈敏度低，而N基因具有很高的靈敏度但特異性不足，同時檢測ORF1ab 基因，E 基因和N 基因可以保證對SARSCoV-2 的敏感性和特異性。為了提高擴(kuò)增效率和耐受性，Lu 等［15］開發(fā)了基于SARS-CoV-2 的N 基因的利用高保真DNA 聚合酶的單步單管耐錯配擴(kuò)增技術(shù)，可除去擴(kuò)增過程中引物3′端的錯配堿基，具有極好的耐受性，檢測限為每個反應(yīng)118.6 個拷貝。該分析的檢測速度比一般LAMP反應(yīng)更快，可在不到20 min 得到結(jié)果。作為一種常見的反應(yīng)平臺，微流控芯片具備將所有試劑存儲在芯片上的能力，能夠整合并簡化操作步驟，對于消除對大型設(shè)備的需求至關(guān)重要，將微流體設(shè)備與等溫擴(kuò)增結(jié)合使用可以為大眾提供更方便、便宜、便攜的新冠檢測方法［16-17］。以上這些LAMP 方法用于即時檢測均需要熱板或水浴，Gonzalez 等［18］報告了一種3D 打印孵育室的開發(fā)，將靶向N 基因的比色RT-LAMP 反應(yīng)與用于市售Eppendorf PCR 管的3D打印孵育室相結(jié)合，可以允許十二管反應(yīng)同時進(jìn)行，3D 打印孵育室可以大規(guī)模生產(chǎn)，為基于LAMP的即時檢測提供了一種高成本效益的反應(yīng)平臺。

LAMP 方法靈敏度高、特異性好，具有恒溫反應(yīng)的優(yōu)勢，無需使用熱循環(huán)儀進(jìn)行溫度程序設(shè)置，更加有利于即時檢測方法的開發(fā)。然而，由于LAMP 需在60～65 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增，仍然需要水浴、熱板等外部設(shè)備提供恒定的溫度，不利于設(shè)備小型化便攜化，因此在常溫下進(jìn)行等溫擴(kuò)增的方法在即時擴(kuò)增領(lǐng)域更有前景。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA） RPA也是一種核酸等溫擴(kuò)增方法，相比于LAMP反應(yīng)溫度更低，在常溫下就可以實現(xiàn)反應(yīng)，無需外部加熱部件。RPA的原理見圖2，主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA 聚合酶。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA 復(fù)合物靶向模板DNA 中的同源序列，通過鏈置換DNA 聚合酶發(fā)生鏈置換反應(yīng)并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA 單鏈與SSB 結(jié)合防止進(jìn)一步替換以穩(wěn)定開放的雙鏈體結(jié)構(gòu)。結(jié)果可以通過與exo 探針結(jié)合進(jìn)行實時熒光定量、也可以與nfo 探針結(jié)合使用側(cè)流試紙條檢測或加入染料肉眼可視化檢測讀取，更適合應(yīng)用于即時檢測。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）原理示意圖

Behrmann 等［19］開 發(fā)了 應(yīng)用exo 探 針的 單管RT-RPA 方法，與RT-qPCR 相比具有100%的診斷敏感性和特異性，檢測限為每個反應(yīng)7.74個拷貝，對于高RNA 濃度樣本，可在7 min 內(nèi)獲得結(jié)果，該測定方法是迄今為止SARS-CoV-2 最快的基于核酸的檢測方法之一。Xia 等［11］提出同時靶向N 和S基因的一管“樣品進(jìn)結(jié)果出”方案，檢測限低至每微升0.2 個拷貝。Tholoth 等［20］將RPA 和LAMP 相結(jié)合，構(gòu)建了用于檢測COVID-19 的兩階段等溫擴(kuò)增，稱為COVID-19 Penn-RAMP，第一階段在管帽中與外部LAMP 引物初步反應(yīng)，通過RPA 擴(kuò)增所有靶標(biāo)，第二階段試管離心或翻轉(zhuǎn)，混合RPA 和LAMP 體系，啟動高度特異性的LAMP 反應(yīng)，進(jìn)一步組合其他4種RAMP 引物，這種嵌套結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)更高的靈敏度，并且對抑制劑有更好的耐受性。

RPA方法靈敏度高，無需加熱部件在常溫下即可擴(kuò)增，并且反應(yīng)速度相較于LAMP 更快，然而由于專利原因，相關(guān)試劑需要從指定公司購入，導(dǎo)致成本提高并且限制了該方法在即時檢測上的應(yīng)用。

2.2.3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(nicking enzyme amplification reaction，NEAR） NEAR 原理見圖3，反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶和恒溫擴(kuò)增DNA 聚合酶驅(qū)動，DNA 模板與引物雜交，延伸產(chǎn)物被下一個模板置換，置換產(chǎn)物互補(bǔ)鏈延伸形成切口酶識別位點(diǎn)，切口酶識別并切割雙鏈DNA 中的一條鏈的特定短序列形成缺口，恒溫擴(kuò)增的DNA 聚合酶從引物的3′端延伸核苷酸繼續(xù)合成短序列，得到NEAR擴(kuò)增雙鏈，通過切割、延伸循環(huán)不斷擴(kuò)增靶標(biāo)DNA 模板，設(shè)計分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號用于定量［21］。NEAR可達(dá)到指數(shù)速率擴(kuò)增，該方法的優(yōu)勢在于速度和靈敏度，缺點(diǎn)在于短序列的設(shè)計存在高假陽性的可能。

圖3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)原理示意圖

3 檢測方法

3.1 實時熒光檢測

實時熒光檢測原理為在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過程中讀取熒光信號以實現(xiàn)定量。在RT-PCR 常用的方法為嵌入熒光染料法和Taqman 探針法。嵌入熒光染料法是指使用能與DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性結(jié)合的熒光染料（例如SybrGreen），Taqman 探針法是指設(shè)計包含5′熒光團(tuán)和3′淬滅基團(tuán)的短的寡核苷酸探針與DNA模板中的序列退火，Taq聚合酶通過其5′至3′核酸外切酶活性切割退火的探針上的熒光基團(tuán)，使其發(fā)出熒光。測定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號達(dá)到熒光閾值時所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct）即可進(jìn)行定量。RPA 在常溫下就可以反應(yīng)，其結(jié)果可以通過與exo 探針結(jié)合進(jìn)行實時熒光定量。Behrmann 等［19］引入內(nèi)部淬火探針（exo-IQ）的概念，猝滅基團(tuán)通過內(nèi)部linker 連接在兩個核苷酸之間，克服了exo 探針對胸腺嘧啶距離的設(shè)計限制，該策略大大簡化了exo 探針的設(shè)計。在標(biāo)準(zhǔn)化實驗室采用的實時熒光檢測需要體積較大的實時熒光檢測儀，檢測人員也需要經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練，因而專門為即時檢測開發(fā)的商業(yè)化檢測儀器對實時熒光檢測儀進(jìn)行小型化處理，使其與樣本提取擴(kuò)增整合并且使結(jié)果易于讀取，更適合即時檢測環(huán)境，但由于仍需專門的儀器，在成本及推廣應(yīng)用方面存在限制。

3.2 可視化檢測

相比于熒光檢測需要專門的儀器進(jìn)行信號讀取，可視化檢測只需肉眼觀察即可，使得結(jié)果的讀取簡單直觀，更適合即時檢測?？梢暬瘷z測包括添加pH 敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等方法。

可視化檢測常應(yīng)用于等溫擴(kuò)增，Park 等［22］設(shè)計針對Nsp、S 和ORF8 基因的引物對，應(yīng)用無色結(jié)晶紫實現(xiàn)比色檢測，可在30 min 內(nèi)得出結(jié)果，特異性好，檢測限為每個反應(yīng)100 個拷貝。Yan 等［23］通過實時濁度監(jiān)測和熒光鈣黃綠素可視化，平均可在26.28 min 中檢測到SARS-CoV-2。通過130 個臨床樣本驗證，靈敏度和特異性均為100%。Yu等［13］選擇了一種新型的核酸染料GeneFinder?以進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號和靈敏度?？梢暬瘷z測可以使得等溫擴(kuò)增進(jìn)一步適應(yīng)即時檢測的使用場景，減少操作人員的專業(yè)要求，也不需要專門的設(shè)備，但相比于熒光檢測，靈敏度會有所下降。而結(jié)合智能手機(jī)的成像和傳感平臺可以實現(xiàn)可視化結(jié)果的量化［17，24］，相比于目視判定更加客觀，可以提高檢測準(zhǔn)確度。并且使用智能手機(jī)應(yīng)用程序可以快速診斷疾病，監(jiān)控個人或人群的健康狀況，并向云端上傳地理和人口數(shù)據(jù)用于流行病學(xué)分析。開發(fā)結(jié)合智能手機(jī)的設(shè)備有利于快速、準(zhǔn)確地應(yīng)對當(dāng)前以及未來的傳染病爆發(fā)［25］。

3.3 側(cè)向流檢測

基于紙張的側(cè)向流分析（LFA）成本低，易于制造且與即時檢測完全兼容，是居家檢測或資源貧乏地區(qū)檢測的富有潛力的工具。Xia 等［11］進(jìn)一步提出一種更簡化的甚至可以在家中進(jìn)行檢測的RT-RPA 方法，設(shè)計了nfo-affinity 探針系統(tǒng)以及用于RNA 檢測的側(cè)向流動試紙條，可以目視檢測到最低1 ag N 基因RNA，考察發(fā)現(xiàn)該方法可以簡單地通過使用保溫杯來執(zhí)行。AuNPs合成便利，表面可以被數(shù)百種核酸修飾?？赏ㄟ^由AuNPs 聚集引起的顏色變化進(jìn)行比色測定，閉管的反應(yīng)形式可以最大程度地減少操作步驟并避免交叉污染。Moitra 等［26］用針對SARS-CoV-2 N 基因的巰基修飾的反義寡核苷酸封閉的AuNPs 以及RNaseH 以實現(xiàn)在10 min 內(nèi)通過觀測沉淀來“裸眼”選擇性檢測SARS-CoV-2。但檢測限為0.18 ng/μL RNA，因此僅采用納米粒子不足以靈敏檢測病毒RNA，將其引入核酸擴(kuò)增系統(tǒng)中可以增強(qiáng)SARS-CoV-2 檢測的靈敏度和特異性，同時實現(xiàn)可視化側(cè)向流檢測。Zhu 等［27］結(jié)合了針對ORF1ab、N 基因的RT-LAMP與基于納米顆粒的側(cè)向流生物傳感器的分析方法，檢測限每個反應(yīng)可達(dá)12個拷貝，分析靈敏度和特異性均為100%。從樣品收集到得出結(jié)果，整個診斷測試可在1 h 內(nèi)完成。此外也有商業(yè)化儀器采用側(cè)向流技術(shù)作為檢測方法例如Accula（Mesa Biotech），避免了使用熒光探針和檢測器的需求。

3.4 CRISPR/Cas檢測

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是用于基因編輯的常用工具，有準(zhǔn)確識別和切割特定序列的能力，而活化的Cas 酶在特異性切割靶RNA 的同時能夠非特異性地切割周圍環(huán)境中的RNA 或DNA，可利用這一特性實現(xiàn)核酸檢測。

3.4.1 SHERLOCK SHERLOCK（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）的原理見圖4，將病毒RNA 靶標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后通過等溫擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物被T7RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄回RNA 以此擴(kuò)增靶RNA。Cas13a 是一種非特異性RNase，識別并結(jié)合靶向擴(kuò)增的RNA 產(chǎn)物后被激活，對附近的非靶向RNA 進(jìn)行非特異性反式核酸內(nèi)切酶切割即“附帶”切割，裂解ssRNA 報告分子使其從淬滅劑中釋放出熒光染料，用于信號放大和核酸檢測，并允許熒光，比色，側(cè)向流動等讀出方法來快速檢測各種靶標(biāo)［28］。Zhang 等［29］發(fā)布了用于檢測SARS-CoV-2 的SHERLOCK 流程，靶向Orf1ab 和S 基因，RPA 等溫擴(kuò)增后Cas13 切割，在商業(yè)化試紙條上讀取結(jié)果，3 步檢測僅需約1 h，但只使用合成的RNA 對新冠病毒CRISPR 檢測的表現(xiàn)進(jìn)行了評估，未用患者樣本進(jìn)行檢測。Hou等［30］在RNA 提 取 步 驟 之 后，用 靶 向Orf1ab 的SHERLOCK 方法得到近單拷貝的靈敏度及良好的特異性。在52 個患者臨床樣本中驗證具有100%的臨床靈敏度，周轉(zhuǎn)時間僅需40 min，證明了其診斷潛力。

圖4 SHERLOCK原理示意圖

SHERLOCK 是兩步反應(yīng)：首先RT-RPA擴(kuò)增再轉(zhuǎn)錄回RNA 進(jìn)行Cas13 檢測，由于涉及兩個單獨(dú)的反應(yīng)步驟，因此需要進(jìn)行液體處理和開管，這不僅增加了復(fù)雜性，而且大大增加了樣品交叉污染的可能性，不適宜在良好控制的實驗室環(huán)境范圍外使用。為了使SHERLOCK 能在即時檢測領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，Joung 等［31］開發(fā)了在一鍋中進(jìn)行SHERLOCK 測試的方法，稱為STOPCovid（SHERLOCK Testing in One Pot），將LAMP 與CRISPR 介導(dǎo)的檢測步驟相結(jié)合，將經(jīng)典的兩步SHERLOCK轉(zhuǎn)化為單步反應(yīng)，不需要樣本提取，檢測限為100個拷貝，可在1 h 內(nèi)用商業(yè)側(cè)向流試紙條或熒光讀數(shù)檢測，并通過臨床樣本進(jìn)行了驗證，適用于即時檢測。

3.4.2 DETECTR Cas12 是CRISPR-Cas 效 應(yīng) 子家族的另一個成員，具有靶標(biāo)激活的非特異性單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）特性，是一種RNA 引導(dǎo)的DNA 核酸內(nèi)切酶，在結(jié)合靶序列后會不加區(qū)別地裂解ssDNA。在DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）方法中（圖5），病毒RNA 首先被轉(zhuǎn)化為DNA，然后等溫擴(kuò)增后的DNA 中的特定靶序列激活Cas12a，Cas12a 依次切割ssDNA 報告探針釋放肉眼可見的熒光分子，可實現(xiàn)靈敏且特異的DNA檢測［32］。

圖5 DETECTR檢測原理示意圖

基于熒光的檢測方法相對靈敏度更高且可以實現(xiàn)高通量檢測，Huang 等［33］采用一步式RT-RPA方法從鼻拭子提取的病毒RNA 中擴(kuò)增靶區(qū)域，并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物整體轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板中進(jìn)行熒光檢測，使用熒光板讀取器進(jìn)行信號讀取，易于實現(xiàn)自動化，樣品到結(jié)果的時間約為50 min，檢測限為每個反應(yīng)2 個拷貝，靈敏度優(yōu)于qPCR 測定法。該方法可以應(yīng)用于大多數(shù)設(shè)備齊全的臨床實驗室中，但是需要進(jìn)一步設(shè)計適當(dāng)?shù)脑O(shè)備應(yīng)用于即時檢測，以使資源缺乏的小型診所也能進(jìn)行該測試。CRISPR 還可以使用側(cè)向流試紙條來檢測信號，它不需要任何設(shè)備即可快速讀取結(jié)果，更適合應(yīng)用于非實驗室環(huán)境中的即時檢測，對于單樣本測試，這是一個很好的解決方案，具有便攜低成本的優(yōu)勢，但使用側(cè)向流試紙條檢測結(jié)果的方法靈敏度會有所降低［34-35］。以上開發(fā)的方法仍需對樣本進(jìn)行開管進(jìn)行液體操作，為了解決這一問題，Ding 等［36］提出All-In-One Dual CRISPR-Cas12（AIOD-CRISPR）檢測方法，用于核酸擴(kuò)增和CRISPR 檢測的所有成分都在一個單管反應(yīng)系統(tǒng)中，靈敏度能達(dá)到每微升4.6 個拷貝。而Guo 等［37］建立了一個集成樣品處理方案、重組酶輔助擴(kuò)增（RAA）及CRISPR 檢測的病毒核酸檢測平臺，檢測限為每毫升1×104拷貝，為了使該平臺更適合即時檢測，還構(gòu)建了一個帶有藍(lán)色LED 的便攜式暗盒以便實現(xiàn)可視化。

基于RNA 的CRISPR/Cas 策略與等溫擴(kuò)增結(jié)合的快速核酸檢測技術(shù)，可以提高等溫擴(kuò)增測定的靈敏度，特異性和可靠性，CRISPR 檢測還可與側(cè)向流讀數(shù)耦合，很適合居家檢測的場景，為下一代分子診斷技術(shù)的發(fā)展和即時檢測的應(yīng)用展示了廣闊的前景。

4 商業(yè)一體化即時檢測方法

商業(yè)化即時檢測方法通常通過開發(fā)配套儀器設(shè)備來實現(xiàn)整合提取、擴(kuò)增及檢測過程，將所有試劑裝在一個盒中，并通過使用機(jī)械操作或微流控技術(shù)以基本實現(xiàn)自動化、最大程度地減少人工操作，減少總測試時間，提高周轉(zhuǎn)速度。

從2020 年3 月開始，美國食品和藥物管理局（FDA）對多項測試授予了EUA，值得注意的是有越來越多基于RT-PCR 原理的即時檢測商業(yè)化測試正在被開發(fā)。目前獲得臨床實驗室改進(jìn)修正案的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（CLIA）豁免的基于RT-PCR 原理進(jìn)行SARS-CoV-2 測試的即時檢測有Cepheid 公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2 和Mesa Biotech 公 司Accula SARS-CoV-2［38］。Xpert Xpress SARS-CoV-2（Cepheid）通過RT-PCR 檢測E 基因和N2 基因兩個靶標(biāo)，在大約45 min 內(nèi)即可得到結(jié)果，將整個過程自動化，不需要用戶進(jìn)行特殊培訓(xùn)。許多研究團(tuán)隊將Xpert Xpress SARS-CoV-2 與基于實驗室的RT-PCR 在臨床樣本中進(jìn)行了比較，顯示出極好的一致性（＞99%），并且發(fā)現(xiàn)在較低的病毒水平也能可靠檢測［39］。Mesa Biotech 公司的Accula 結(jié)合了RT-PCR 分子診斷和側(cè)向流分析技術(shù)，僅需30 min即得到結(jié)果并且儀器僅手掌大小便于攜帶。為了評估Accula 測試的性能，Hogan 等［40］比較了100 份鼻咽拭子樣品的結(jié)果，總體一致性為84.0%，陽性一致性僅有68.0%。對于病毒載量低的樣品，陽性一致性較低，易出現(xiàn)假陰性。這表明Accula 即時檢測靈敏度不高，應(yīng)仔細(xì)考慮即時檢測的潛在優(yōu)勢與降低診斷準(zhǔn)確性之間的平衡。國內(nèi)基于RT-PCR 原理的商業(yè)化即時檢測裝置有圣湘生物科技股份有限公司的iPonatic 移動分子診斷系統(tǒng)、上海透景生命科技股份有限公司2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（卡式熒光PCR 法）。iPonatic采用一步核酸免提取技術(shù)，并搭配快速核酸檢測系統(tǒng)，一站式完成樣本裂解、核酸提取、PCR 擴(kuò)增及結(jié)果分析。透景生命的檢測卡盒采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，實現(xiàn)提取擴(kuò)增全程自動化，但該方法需要手動裝載磁珠和樣本，需要在標(biāo)準(zhǔn)實驗室環(huán)境下進(jìn)行。此外還有能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR（mPCR）的商業(yè)化平臺，例如QIAstat-Dx（QIAGEN 公司）、BioFire FilmArray（bioMérieux 公司）等平臺。QIAstat-Dx 除了支持液體運(yùn)輸介質(zhì)外，還有獨(dú)特的干拭子直接上樣程序，手動操作少于1 min，可在1 h內(nèi)得出結(jié)果。BioFire FilmArray（bioMérieux 公司）利用巢式多重PCR 結(jié)合微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)1 h快速檢測，巢式PCR 技術(shù)可以最大程度排除其他非特異性病原體核酸物質(zhì)的干擾，同時提高了檢測靈敏度。表1列舉了目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時檢測方法［38，41］。

表1 目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時檢測方法

等溫擴(kuò)增由于不需要借助熱循環(huán)儀，在恒定溫度下即可實現(xiàn)擴(kuò)增和可視化檢測，因而可以大大減小設(shè)備體積，相對于RT-PCR 更適合用于資源缺乏地區(qū)即時檢測的開發(fā)。北京航空航天大學(xué)、華西醫(yī)院聯(lián)合研發(fā)出一款針對ORF/N/E 3 個基因位點(diǎn)的便捷式病原體核酸快速檢測儀，由便攜式檢測儀和等溫擴(kuò)增檢測錐形微孔陣列高通量芯片構(gòu)成，能實現(xiàn)高靈敏度、低成本（1萬元/臺，10元/人份）、快速（25 min）、高通量（64 個）即時檢測，113例核酸樣本檢測表明靈敏度大于95%，特異性大于95.3%。優(yōu)思達(dá)公司EasyNAT 即時分子診斷系統(tǒng)是已獲批的一體化等溫擴(kuò)增儀器，試劑用玻璃化技術(shù)預(yù)混裝在全自動反應(yīng)管中，將裂解、磁珠提取、純化、洗脫、擴(kuò)增等過程在外部磁導(dǎo)的作用下自動化完成，整個過程耗時79 min，全程密閉檢測，無需專業(yè)PCR 實驗室。Abbott 公司的ID Now 是利用NEAR原理的一種商業(yè)化即時檢測方法，它設(shè)計靶向擴(kuò)增SARS-CoV-2 的RdRp 片段，可在5 min 內(nèi)提供0.125 copies/μL 的靈敏度。檢測陽性樣品僅需5 min，陰性樣品也只需13 min。用熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)特異性鑒定擴(kuò)增的RNA 靶標(biāo)。然而，有評估顯示ID NOW 與RT-PCR 陽性一致率僅有約80%［42］，這意味著Abbott 公司的ID Now 的性能有很大的局限性，對于強(qiáng)陽性和中等陽性樣品，ID NOW 表現(xiàn)良好，但對于弱陽性樣品靈敏度降低［43］，因此在對疑似患者使用此測試時，應(yīng)考慮到靈敏度的問題。等溫擴(kuò)增一體化儀器適合資源缺乏地區(qū)以及人流聚集環(huán)境下的便攜式病原體快速檢測，但目前對于低成本、高準(zhǔn)確度、適合即時檢測的等溫核酸擴(kuò)增儀的開發(fā)仍處于探索階段，有廣闊的發(fā)展前景。

5 總結(jié)和展望

相比于基于實驗室的標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR 流程，即時檢測方法能夠在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)“樣本進(jìn)，結(jié)果出”，可以促進(jìn)更快的臨床決策，以社區(qū)為單位進(jìn)行即時檢測可以減輕中心醫(yī)院和實驗室的負(fù)擔(dān)。目前已開發(fā)出許多為了更好地應(yīng)用于新冠即時檢測而在提取、擴(kuò)增、檢測等方面進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)的方法，包括簡化提取步驟，優(yōu)化即時檢測場景下基于RT-PCR、核酸等溫擴(kuò)增等原理開發(fā)的方法（表2）的擴(kuò)增性能、采用熒光讀取、可視化技術(shù)、側(cè)向流檢測和CRISPR 檢測以方便結(jié)果識別讀出等，推動實現(xiàn)準(zhǔn)確，快速，便攜，簡便和低成本的即時檢測目標(biāo)。但目前針對新冠檢測的即時檢測方法大多為概念研究階段，距離商品化應(yīng)用還有距離。而已被批準(zhǔn)上市的即時檢測方法需要在專門的配套儀器上使用，實現(xiàn)了提取、擴(kuò)增、檢測一體化，極大推動了即時檢測的發(fā)展，但大多仍然需要專業(yè)人員在實驗室環(huán)境操作，且儀器價格較高、市場占有率小等問題也會限制其在即時檢測場景中的應(yīng)用，此外部分商品化儀器實際檢測性能仍有待進(jìn)一步評估和改進(jìn)，市場上仍缺少真正能夠?qū)崿F(xiàn)普通大眾居家或資源缺乏地區(qū)在非實驗室環(huán)境進(jìn)行測試的準(zhǔn)確可靠的即時檢測試劑盒，對于在受控環(huán)境之外和非專業(yè)訓(xùn)練的工作人員進(jìn)行測試時的污染和假陽性風(fēng)險也是即時檢測所面臨的問題。即時檢測方法的開發(fā)主要是為了應(yīng)用于資源短缺地區(qū)或待檢樣品數(shù)超過當(dāng)?shù)貦z測能力地區(qū)的現(xiàn)場即時檢測，這就要求理想的研發(fā)方法能夠具有以下特征：（1）裝置盡量小型化、便攜化；（2）用戶友好，操作簡單，方便非專業(yè)操作人員的培訓(xùn)；（3）考慮到生物安全問題，盡量設(shè)計為免提取密閉自動化操作，減少開蓋，保證非專業(yè)人員在非實驗室環(huán)境操作的安全；（4）周轉(zhuǎn)時間短，能在1～2 h 或更短時間內(nèi)出結(jié)果；（5）信號讀取方便直觀，可以直接得出是否為陽性的結(jié)果，例如可視化技術(shù)。除了為快速控制新冠病毒的傳播提供有力支持以外，這些針對新型冠狀病毒的即時檢測研究成果也可以應(yīng)用于其他疾病的緊急防御和快速部署，有助于應(yīng)對未來可能的新興傳染病。

表2 基于不同原理的SARS-CoV-2核酸即時檢測方法對比