陳映潔，高向東，陳 松

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京211198）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢反射障礙等癥狀［1］。PD主要病理特征包括黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元死亡和減少［1-2］以及異常聚集α-突觸核蛋白（αsynuclein，α-syn）形成的路易小體等［3］。隨著人口老齡化和全球人均預(yù)期壽命的延長，PD 患病人數(shù)逐年上升。PD 具體發(fā)病機制目前尚無定論，其復(fù)雜性伴隨著臨床挑戰(zhàn)，因此，PD的發(fā)病機制和治療方案受到研究者們的廣泛關(guān)注。

研究表明，神經(jīng)退行性疾病與糖尿病之間存在關(guān)聯(lián)［4-5］，從糖脂代謝調(diào)節(jié)分子中尋求神經(jīng)退行性疾病的防治藥物可能是有效研究策略。成纖維細(xì) 胞 生 長 因 子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）是成纖維細(xì)胞生長因子家族的一員，其作為代謝調(diào)控的研究熱點之一，在糖尿病相關(guān)疾病治療中具有一定的潛力。有文獻(xiàn)報道，情緒穩(wěn)定劑鋰和丙戊酸可能通過FGF21 發(fā)揮協(xié)同神經(jīng)保護作用，F(xiàn)GF21可能成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的先導(dǎo)分子［6］。已有研究表明FGF21 可以保護動物大腦 抵 抗D- 半 乳 糖［7］和Aβ25-35［8］的 影 響，提 示FGF21［8-9］可能在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮一定的潛在作用。然而，F(xiàn)GF21 在PD 中具體作用及機制尚有待進一步深入研究。

本研究采用魚藤酮建立PD 樣損傷神經(jīng)細(xì)胞模型，考察在該模型下FGF21 對神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和α-syn 變化、以及胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響，在細(xì)胞水平上探討FGF21 對魚藤酮導(dǎo)致PD 樣神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護作用及機制。

1 材 料

1.1 試 劑

FGF21（純度：95.66%，實驗室制備）；魚藤酮（純度：98.12%，美國MCE 公司）；ROS 檢測試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；胰蛋白酶、MTT（中國Biosharp 公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；蛋白酶抑制劑、Marker（美國Thermo 公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；β-actin 抗體（中國Abclonal 公司）；TH 抗體，α-syn 抗體，羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG（美國Cell Signaling Technology 公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀 器

高速冷凍離心機、全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（中國Tanon 公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 細(xì) 胞

SH-SY5Y 細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，放置于37 ℃含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中3～4 d，待生長到約80% 時進行傳代。

2.2 魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型建立[10]

收集密度為每毫升5×104個的SH-SY5Y 細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 鋪在96 孔細(xì)胞板內(nèi)，鋪板時注意充分混勻。10 h 后以梯度濃度0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 ，0.025 μmol/L 的魚藤酮孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h，MTT 法檢測細(xì)胞活性：每孔加入MTT 10 μL，37 ℃放置4 h，吸去培養(yǎng)基，各孔加入DMSO 150 μL 并放于搖床震搖10 min 使結(jié)晶物充分溶解，設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)為570 nm 為檢測波長，630 nm為參比波長，檢測各孔內(nèi)吸收度。

2.3 FGF21 對魚藤酮致SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞鋪于96 孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h 后，選取0.1 μmol/L 魚藤酮作為造模濃度，同時選用濃度為5，1，0.2，0.04，0.008 μmol/L的FGF21干預(yù)細(xì)胞24 h后，MTT法檢測各組細(xì)胞活性。

2.4 FGF21及魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

收集狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞，以每毫升5×104個細(xì)胞的密度，每孔1 mL 鋪于6 孔板，選取0.1 μmol/L 魚藤酮作為造模濃度，5 μmol/L FGF21作為給藥濃度，實驗分為空白組、模型組和給藥組，共孵育24 h 后，采用Annexin V-FITC/PI 雙染法結(jié)合流式檢測SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況。實驗步驟：收集每組細(xì)胞培養(yǎng)液于EP管內(nèi)，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，用胰酶消化并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞間隙變大立即用收集的細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打?qū)?yīng)的各組細(xì)胞收集到EP 管中，1 000 r/min 離心5 min，棄除上清液，PBS 重懸細(xì)胞計數(shù)。每個EP 管中加入Annexin V-FITC 結(jié)合液195 μL 與細(xì)胞充分混勻，并加入Annexin V-FITC染色液5 μL 和PI 染色液10 μL，上下顛倒輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，上機前重懸細(xì)胞，檢測各組熒光值，各組細(xì)胞避光放于冰上并于1 h 內(nèi)完成檢測。

2.5 FGF21 及魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞TH 和αsyn表達(dá)量的影響

細(xì)胞鋪板及給藥干預(yù)實驗步驟見“2.4”項。共孵育24 h 后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot 檢測各實驗組TH 和α-syn 蛋白水平變化。實驗步驟：使用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入RIPA 裂解液（按1∶200 加入蛋白酶抑制劑），細(xì)胞板置于冰上，細(xì)胞刮刀輕輕刮取細(xì)胞收集于EP 管中，渦旋儀每隔3 min 充分振蕩裂解30 min，然后在4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min取上清液即為細(xì)胞總蛋白，蛋白制樣后進行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)恒流轉(zhuǎn)膜40 min，轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜以5% 脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，孵育一抗放置于搖床上4 ℃過夜，TBST 洗滌后放置于搖床上常溫孵育二抗2 h，洗滌、化學(xué)發(fā)光顯色成像，檢測目的蛋白變化。

2.6 FGF21 及魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成水平的影響

細(xì)胞鋪板及給藥干預(yù)實驗步驟見“2.4”項。共孵育24 h 后，采用DCFH-DA 探針結(jié)合流式檢測SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。實驗步驟：以無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA 溶液使其終濃度為10 μmol/L 并避光保存；輕輕吸去6 孔板內(nèi)培養(yǎng)基，用胰酶消化并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞間隙變大立即用DMEM 高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹打并收集在EP 管內(nèi)，1 500 r/min 離心5 min，棄培養(yǎng)基，每管加入已稀釋的DCFH-DA 溶液1 mL，重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育20 min，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基洗滌3 次，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞熒光強度。

2.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用GraphPad 分析軟件進行統(tǒng)計分析，以xˉ± s表示，One-way ANOVA 檢驗進行組間比較，P ＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型建立

以不同濃度魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞后，MTT法檢測細(xì)胞活性。結(jié)果如圖1所示，魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞活性損傷呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)0.1 μmol/L 魚藤酮作用于SH-SY5Y 細(xì)胞24 h時，與對照組比，細(xì)胞損傷率約為30%，選取該濃度為魚藤酮的造模濃度。

Figure 1 Effects of different concentrations of rotenone on SH-SY5Y cell viability (xˉ± s, n = 6)## P＜0.01 vs control group

3.2 FGF21 對魚藤酮致SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

根據(jù)“3.1”項實驗結(jié)果，選用0.1 μmol/L 魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞，分別與梯度濃度FGF21 孵育24 h 后，MTT 檢測細(xì)胞活性。結(jié)果如圖2 所示，魚藤酮模型組與對照組相比細(xì)胞活性下降；給藥FGF21 后，與模型組相比，給藥組細(xì)胞活性增加，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

3.3 FGF21及魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

采用魚藤酮對神經(jīng)細(xì)胞損傷并進行FGF21 干預(yù)，Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。流式檢測結(jié)果如圖3 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡比例顯著升高，F(xiàn)GF21 給藥組其細(xì)胞凋亡比例顯著少于模型組，說明FGF21 對魚藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡具有一定干預(yù)作用，并對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護作用。

Figure 2 Protective effects of FGF21 against rotenone-induced toxicity on SH-SY5Y cells (xˉ± s, n = 6)##P＜0.01 vs control group;** P＜0.01 vs rotenone group

3.4 FGF21 及魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞TH 和αsyn表達(dá)量的影響

用0.1 μmol/L 魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞損傷造模，采用5 μmol/L FGF21 進行干預(yù)，Western blot 檢測各實驗組細(xì)胞TH和α-syn的表達(dá)量。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，魚藤酮損傷后細(xì)胞TH水平下降，α-syn水平升高；而FGF21能一定程度上緩解模型組中TH 和α-syn 的表達(dá)量的異常。說明FGF21能緩解魚藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞PD樣病理改變。

3.5 FGF21 及魚藤酮對SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成水平的影響

采用魚藤酮對神經(jīng)細(xì)胞損傷并進行FGF21 干預(yù)，DCFH-DA 探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。結(jié)果如圖5 所示，與對照組相比，魚藤酮損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS 顯著增加，而FGF21 給藥組與模型組相比ROS 顯著降低，說明FGF21 可緩解魚藤酮引起的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平異常，對細(xì)胞發(fā)揮了一定的抵抗氧化損傷的作用。

Figure 3 Effects of FGF21 and rotenone on the apoptotic levels of SH-SY5Y cells (xˉ± s, n = 3)A:Analysis of apoptotic levels in SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of apoptotic levels## P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs rotenone group

Figure 4 Effects of FGF21 and rotenone on the protein levels of TH and α-syn in SH-SY5Y cells (xˉ± s, n = 3)A:Detection of protein levels of TH and α-syn by Western blot;B:Quantitative analysis of protein levels of TH;C:Quantitative analysis of protein levels of α-syn## P＜0.01 vs control group;** P＜0.01 vs rotenone group

Figure 5 Effects of FGF21 and rotenone on the ROS levels in SH-SY5Y cells (xˉ± s, n = 3)A:Analysis of ROS levels in SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of ROS levels##P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs rotenone group

4 討 論

PD 是世界第二大神經(jīng)退行性疾病，僅次于阿爾茨海默病，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無定論，缺乏有效的治愈手段，使得大量研究尋求新的治療思路與治療靶標(biāo)。研究表明FGF21 能以簡單擴散的方式通過血腦屏障［11］，并且FGF21 相關(guān)的受體系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有表達(dá)［12］，這為FGF21 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用提供了前提。近年來，F(xiàn)GF21 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的生物學(xué)作用引起了研究者極大的關(guān)注［13-14］。體外研究發(fā)現(xiàn)FGF21能夠增加線粒體呼吸鏈活性從而發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用［15］。然而，F(xiàn)GF21 在PD 中具體作用及分子機制尚有待進一步研究。本研究采用魚藤酮建立神經(jīng)細(xì)胞PD 樣損傷模型，探索FGF21對神經(jīng)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明FGF21 能夠降低魚藤酮所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。說明FGF21 對PD 樣細(xì)胞模型發(fā)揮了一定的保護作用。

PD發(fā)病機制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激在PD發(fā)生機制中備受關(guān)注。越來越多的研究表明氧化應(yīng)激異常和線粒體功能障礙會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及多巴胺能神經(jīng)元退化和死亡［16-19］。PD 相關(guān)基因如SNCA/α-syn，Parkin，LRRK2 等的突變與帕金森病風(fēng)險增加有關(guān)，且這些基因的突變在一定條件下會對線粒體產(chǎn)生重要影響，而線粒體功能的受損則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激異常［20］。導(dǎo)致PD 發(fā)生的幾種神經(jīng)毒素如1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶，6-羥基多巴胺，百草枯和魚藤酮等對線粒體復(fù)合體Ⅰ發(fā)揮抑制作用，抑制ATP 產(chǎn)生，阻斷細(xì)胞內(nèi)ATP參與的過程，產(chǎn)生大量自由基，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激異常［21］。魚藤酮可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激異常以及SHSY5Y 神經(jīng)細(xì)胞TH 和α-syn 相關(guān)PD 樣病變［22-23］。大量研究表明，氧化應(yīng)激調(diào)控策略在緩解神經(jīng)退行性疾病及保護神經(jīng)細(xì)胞中可能具備一定的潛力［8，24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)FGF21可改善魚藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平異常，對PD 相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷能發(fā)揮一定的保護作用，同時FGF21 可緩解魚藤酮引起的TH 和α-syn 異常；說明在PD 相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中，F(xiàn)GF21 可能通過調(diào)節(jié)ROS 相關(guān)途徑從而改善神經(jīng)細(xì)胞PD 樣病變，揭示了FGF21通過調(diào)控氧化應(yīng)激進而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護作用。本研究為FGF21 防治PD 的作用及機制研究提供了實驗基礎(chǔ)，為PD 藥物研發(fā)新思路提供了實驗依據(jù)。FGF21 作為潛在藥物分子，其成藥性還有待進一步研究；FGF21 在PD 等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用的具體分子機制也還需深入探究。