葉倩伶，龍富立，毛德文，王明剛

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530222；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病科

外泌體近年來一直是學者們非常感興趣的醫(yī)學研究話題。它們調(diào)節(jié)細胞-細胞間通訊和參與各種細胞的生理病理事件，可以使供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞并激活和調(diào)節(jié)細胞活性蛋白質(zhì)的表達、增殖和分化等重要反應。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體具有更重要的作用，如細胞信號傳導、基因調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等。越來越多的文獻表明，外泌體參與了肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，介導的細胞間通訊可以改變腫瘤生長、細胞遷移、抗病毒感染、抗纖維化和肝細胞再生等，可能對肝臟疾病具有潛在的診斷和治療作用，是肝臟疾病診治的潛在生物標志物?，F(xiàn)就外泌體在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用作一概述。

1 外泌體簡介

外泌體是天然脂質(zhì)膜封閉的囊泡，直徑為30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/ml，通過透射電子顯微鏡觀察到的外泌體通常是具有凹面的碟形或半球形，是細胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等過程形成。外泌體可以在一系列真核液體中找到，如血漿、尿、腦脊液、唾液、母乳、羊水、支氣管肺泡灌洗液等，可由多種細胞分泌，如肥大細胞、樹突細胞、T 細胞、B 細胞、干細胞、星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞、上皮細胞等[1-3]。外泌體參與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的細胞間信號傳導[3]，攜帶多種分子，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸[4-5]，具有幾種不同的表面分子，能夠激活細胞受體，使其能夠參與細胞之間的物質(zhì)交換(即蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和病原體)[6]。

2 外泌體功能

外泌體曾被認為是體內(nèi)的代謝廢物，然而現(xiàn)在它們已成為調(diào)節(jié)或介導多種細胞過程的重要細胞間通訊載體，外泌體的釋放目前被認為是細胞間通訊的整體機制，其可能影響相鄰細胞和遠端細胞，具有獨特的組織/細胞類型特異性蛋白質(zhì)，可反映其細胞來源[7]。外泌體的產(chǎn)生和釋放機制非常復雜，涉及多種因素，如四跨膜蛋白(CD9、CD63 和 CD81)，熱休克蛋白(Hsp 60、Hsp 70 和 Hsp 90)，生物相關蛋白(Alix 和 TSG 101)，膜轉(zhuǎn)運和融合蛋白(GTPases、膜聯(lián)蛋白和 Rab 蛋白)，核酸(mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA和DNA)，以及脂質(zhì)(膽固醇和神經(jīng)酰胺)等[8-9]。在免疫系統(tǒng)中，外泌體已經(jīng)被證明在介導適應性和先天性免疫應答中起關鍵作用，通過傳播MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ分子相關的抗原來參與抗原呈遞。例如，B-淋巴細胞和樹突狀細胞(DC)來源的外泌體刺激 T 細胞并啟動宿主免疫反應[10-11]。由外泌體遞送的病毒在其中釋放并復制，從而產(chǎn)生影響宿主免疫細胞病毒的系統(tǒng)分布[12]。與病毒感染的細胞相似，細菌感染的細胞，如結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞釋放含有病原體衍生抗原的外泌體，其在細胞內(nèi)細菌感染期間的免疫監(jiān)視中具有重要作用[13]。

3 外泌體在各類肝病中的作用

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，在新陳代謝、解毒、消化、合成、存儲等方面起著重要的生理作用。外泌體在肝臟主要從三種類型的細胞釋放：肝細胞，非實質(zhì)免疫細胞(如Kupffer細胞、自然殺傷細胞、T細胞和B細胞)和非實質(zhì)肝細胞(如肝臟星狀細胞)[14]。肝細胞釋放或接收外泌體，用于健康和受損肝臟的細胞間通訊[15]。正常肝細胞產(chǎn)生的外泌體攜帶各種分子，如蛋白質(zhì)(糖蛋白、脂蛋白和其他物質(zhì))和大量的miRNA。由于外泌體的數(shù)量和組成的改變反映了供體細胞的生理病理狀態(tài)，因此外泌體介導的細胞間通訊在正常肝臟和疾病過程中也是重要的。

3.1 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)HCC是一種常見的惡性腫瘤，全球總生存率低，手術是最有效的治療策略，但超過80%的患者在確診時就失去了機會。因此，迫切需要找到新的抑制轉(zhuǎn)移和復發(fā)的治療方法，進行更有效的全身治療。外泌體攜帶功能活躍的蛋白質(zhì)、RNA 和其他類型的分子，并與癌癥的病理學有關[16]。癌細胞分泌的外泌體可以在細胞存活、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。Li等[17]研究表明，外泌體可以將長鏈非編碼 RNA(lncRNA)FAL1轉(zhuǎn)移到 HCC 細胞，促進細胞生長、增殖、遷移和侵襲。Wang等[18]研究結(jié)果表明，HCC細胞 HepG2 衍生的外泌體可被脂肪細胞主動內(nèi)化并引起顯著的轉(zhuǎn)錄組學改變，特別是誘導脂肪細胞中的炎性表型。腫瘤外泌體處理的脂肪細胞能促進腫瘤生長，增強血管生成，并在小鼠異種移植模型中募集更多巨噬細胞。Liu等[19]研究結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應激的 HCC 細胞通過將外泌體miR-23a-3p 傳遞給巨噬細胞并隨后增加 PD-L1 表達以促進免疫逃逸來下調(diào)巨噬細胞。Chen等[20]證明，高轉(zhuǎn)移性 MHCC97H 細胞的外泌體可以被低轉(zhuǎn)移性 HCC 細胞攝取并隨后促進受體細胞的惡性行為。這些結(jié)果確定了腫瘤來源的外泌體在通過信號傳導促進上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變(EMT)過程中的可能作用，進一步促進HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhou等[21]表示，一方面腫瘤細胞通過外泌體影響鄰近細胞并建立致瘤微環(huán)境，另一方面基質(zhì)細胞和免疫細胞可以影響腫瘤細胞通過外泌體促進或預防腫瘤發(fā)生。通過外泌體交換RNA和蛋白質(zhì)不僅可以在HCC發(fā)病和進展中起關鍵作用，而且可以代表潛在的非侵入性生物標志物及治療靶標的來源，鑒定出HCC復發(fā)和預后的特異性和敏感性生物標志物。

3.2 病毒性肝炎在病毒感染中，外泌體參與傳播病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒反應和操縱微環(huán)境，在病毒性肝炎發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。甲型肝炎病毒(HAV)是嗜肝性正鏈 RNA 病毒。HAV 感染偶發(fā)性地發(fā)生在全世界的流行病中，引起中度至重度急性肝臟炎癥，但不能建立持續(xù)性感染。已有研究證明，eHAV負責病毒的傳播和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的激活[22]。eHAV 可以通過外泌體從HAV衣殼體的內(nèi)體出芽進入細胞內(nèi)多泡體(MVB)[23]。乙型肝炎病毒(HBV)是一種包膜 DNA 病毒，持續(xù)感染導致慢性乙型肝炎(CHB)并增加終末期肝病的風險。干擾素-α(IFN-α)誘導的抗病毒反應可以通過外泌體從肝臟非實質(zhì)細胞傳播到HBV感染的肝細胞[24]。從CHB患者血清中分離的外泌體含有 HBV 病毒成分，其在原始肝細胞和 NK 細胞中誘導活躍的 HBV 感染[25]。丙型肝炎病毒(HCV)是一種嗜肝性包膜病毒，攜帶單鏈正義 RNA 基因組，感染是相關性肝硬化進展為HCC的主要危險因素。HCV 感染和復制通過肝細胞中的miR-192上調(diào)來增加 TGF-β1 mRNA的表達[26]。外泌體 miR-192 通過 TGF-β1刺激不僅刺激LX-2肝星狀細胞系(HSCs)的轉(zhuǎn)分化，并刺激人原代 HSCs 向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化[27]。Devhare等[28]報道，HCV感染的肝細胞釋放外泌體miR-19a促進HSC活化最終引起肝纖維化和其他慢性肝病。Bukong等[29]證明，HCV感染患者的外泌體不僅具有復制病毒 RNA，還增加了釋放外泌體 miR-192和 miR-122水平的能力。HCV感染的肝細胞的外泌體除 TGF-β外還可含有其他抑制因子，其中包含好的病毒因子，如HCV核心和包膜蛋白[30]。當暴露于感染的肝細胞分離的外泌體時，肝臟存活的pDC產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(IFN)，從Ⅰ型或Ⅲ型IFN刺激的肝內(nèi)皮細胞分離的外泌體可以抑制感染肝細胞中的HCV復制[31]。戊型肝炎病毒(HEV)可引起急慢性肝炎。HEV顆粒通過MVB 轉(zhuǎn)移和釋放，外泌體阻滯劑可以顯著降低從細胞釋放的HEV顆粒水平[32]。這些發(fā)現(xiàn)表明，病毒感染和抗病毒反應都是通過外泌體的細胞-細胞通訊介導的，這取決于病原體和靶細胞的類型。因此，外泌體可以被用作抗病毒或疫苗的候選者。

3.3 肝纖維化肝纖維化是由肝臟持續(xù)慢性損傷后不溶性膠原和細胞外基質(zhì)(ECM)成分過量產(chǎn)生和積累引起的，各種慢性肝病都會導致肝纖維化，甚至成肝硬化。HSCs的激活是導致肝纖維化發(fā)展的中心事件[33]。外泌體不僅可以促進肝纖維化的發(fā)展，而且還可以引發(fā)纖維化消退。來自健康人體的外泌體可能對肝纖維化患者有益，其修復受損肝臟的主要機制可能是旁分泌因子的釋放[34]。這些外泌體穿過細胞間隙，在不同肝細胞之間傳遞“治療分子”，致使膠原酶活性升高，活化的肌成纖維細胞凋亡及促炎細胞因子和促纖維化細胞因子的減少，最終導致 ECM 產(chǎn)生減少和肝纖維化消退。Chen等[35]發(fā)現(xiàn)，來自健康供體的血清外泌體具有抗纖維化特性，其部分歸因于在活化的 HSCs或受損的肝細胞中具有治療作用的特定miR成分。但來自受損肝細胞的外泌體富含細胞色素 P450，細胞色素 P450 2E1(CYP2E1)產(chǎn)生的活性氧可以產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫和強氧化劑，CYP2E1水平在各種病理生理條件下升高通過氧化應激機制導致肝細胞凋亡[36]。因此，推測含有 P450 的受損肝細胞來源的外泌體參與脂肪變性的發(fā)展，增加纖維蛋白的表達和肝細胞凋亡。受損肝細胞釋放的外泌體含有腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)和分化簇(CD)40配體，誘導炎癥型巨噬細胞的產(chǎn)生[37]。肝細胞脂毒性脂肪酸損傷產(chǎn)生富含 miR17-92 簇的外泌體，它們被HSCs吸收，導致纖維化激活[38]。來自 CCl4處理的肝細胞的外泌體包括不同類型的自身RNA并識別Toll樣受體3的激活劑，其增加肝γδT細胞中 IL-17的產(chǎn)生，促炎性細胞因子水平的增加與HSCs活化密切相關[39]。IL-17產(chǎn)生的T細胞調(diào)節(jié) Kupffer 細胞中 TGF-β1，可直接激活HSCs[40]。從上皮細胞釋放的外泌體可以激活成纖維細胞引發(fā)纖維化。例如，受損的上皮細胞產(chǎn)生的外泌體被鄰近的成纖維細胞吸收，導致α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生增加從而驅(qū)動肝纖維化[41]。

3.4 酒精性脂肪性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)ALD和NAFLD被認為是肝纖維化的主要驅(qū)動因素。隨著生活水平的不斷提高，ALD的發(fā)生比例逐年升高。除傳統(tǒng)的免疫細胞、炎性因子外，來源于外泌體中的各類蛋白質(zhì)分子及miRNA 分子也是參與ALD發(fā)生和發(fā)展的重要因素。已經(jīng)提出肝細胞衍生的和單核細胞衍生的外泌體均調(diào)節(jié)巨噬細胞表型，導致ALD的炎癥反應。暴露于乙醇的單核細胞釋放大量的外泌體，刺激原始單核細胞極化并分化成 M2巨噬細胞。暴露于酒精的單核細胞也分泌含有增加的 miR-27a 水平的外泌體，促進細胞因子分泌增加，導致其他單核細胞的激活和極化[42-43]。通過外泌體攜帶的CD40配體在ALD的實驗模型中促進巨噬細胞活化[44]。這些發(fā)現(xiàn)表明，疾病狀態(tài)下細胞分泌的外泌體水平增加，并引發(fā)各種病理事件。NAFLD特征是由脂質(zhì)和巨噬細胞相關炎癥誘導的肝細胞功能障礙和死亡導致。源自肝細胞的脂質(zhì)誘導的外泌體含有腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體，并在小鼠骨髓來源的巨噬細胞中誘導炎癥表型[37]。受損的肝細胞還釋放富含神經(jīng)酰胺的外泌體，其具有激活巨噬細胞趨化性，這是在脂毒性條件下向肝臟募集巨噬細胞的潛在機制[45]。NAFLD患者分泌的巨噬細胞和自然殺傷性 T 細胞來源的外泌體水平增加[46]。外泌體參與先天性免疫反應伴脂肪變性，表明它們在從早期 NAFLD 進展到 NASH 的過程中發(fā)揮作用，可能刺激炎癥細胞，導致組織損傷的惡化。

3.5 肝衰竭肝衰竭是指肝臟的合成和代謝功能發(fā)生嚴重障礙，臨床上表現(xiàn)為黃疸、腹水、肝性腦病和凝血功能障礙，可導致多器官功能衰竭和死亡。目前，最終的治療選擇是原位肝移植，但受到器官短缺、高費用和終身免疫抑制藥物需求的限制，迫切需要新的有效治療方法。陳露[47]的實驗結(jié)果顯示，MSCs來源的外泌體注射到急性肝衰竭小鼠模型體內(nèi)后，可顯著抑制小鼠血清中ALT和AST的升高，抑制炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的升高，并抑制肝臟細胞的調(diào)亡。有報道稱，MSCs來源的外泌體可以通過 mRNA 和 miRNA 的水平轉(zhuǎn)移及將抗原呈遞給靶蛋白來減輕組織損傷[48]。Chen等[49]觀察到女性月經(jīng)血來源的外泌體在急性肝功能衰竭中具有抗細胞凋亡能力。外泌體的黏附分子和 mRNA通過水平轉(zhuǎn)移來自人肝干細胞的mRNA 亞群，促進肝切除模型中殘留肝細胞再生[50]。MSCs衍生的外泌體可以抑制炎癥因子的風暴，抑制細胞凋亡，促進血管生成，提供能量支持，促進肝細胞增殖，并通過分子轉(zhuǎn)移和膜結(jié)合促進膽汁恢復以逆轉(zhuǎn)肝衰竭[51]。

4 外泌體作為肝臟疾病診斷和預后的生物標志物

臨床上患者管理決策取決于對肝病嚴重程度和進展的準確評估，肝臟活檢是“黃金標準”，但具有侵入性、昂貴且風險大的特點。外泌體的組分是患者潛在病理狀態(tài)的動態(tài)“指紋”，能夠越過血-腦屏障，穩(wěn)定地在循環(huán)血漿和血清檢測到，分析血液或尿液中的生物標志物所需的流體活組織檢查是微創(chuàng)的，這可能成為鑒定和評估與肝病相關分子特征的新生物標志物。Estrabaud等[52]表示，血清 miR-122 水平與所有基因型的 HCV 水平變化、治療反應、治療結(jié)果密切相關，因此，miR-122 被提出作為肝損傷新的生物標志物。miR-199a 的低表達與 HCC 的惡性潛能及預后不良顯著相關，在Murakami等[53]研究中，持續(xù)免疫應答組血清中 miR-199a 水平顯著高于持續(xù)病毒應答組，血清 miR-199a 在肝硬化和 HCC 患者中顯著下降，表明 miR-199a 可用作 HCC 的潛在生物標志物[54]。miR-21可在肝癌和CHB患者的血清中檢測到。與 CHB 組和健康個體相比，肝癌患者血清外泌體中 miR-21 表達水平顯著增加，并與肝硬化和肝癌分期相關。更重要的是，外泌體 miR-21 的濃度顯著高于全血清，這表明外泌體 miR-21將是更敏感的診斷標志物[55]。在 HCC 患者的血清中，發(fā)現(xiàn) miR-18a、miR221、miR-222 和 miR-224 的外泌體含量均顯著高于肝炎組和肝硬化組，而miR-101、miR-106b、miR-122 和 miR-195表達水平顯著降低[56]。HBV和HCV早期誘導的肝纖維化患者的外泌體中發(fā)現(xiàn)miRNA 的表達增強，表明這些外泌體相關 miRNA可能用作肝纖維化早期階段的標志物[57]?？傊?，這些信息說明可將外泌體作為肝病的潛在診斷生物標志物，但需要進一步開展工作。

5 外泌體可作為肝臟疾病治療新手段

對外泌體含量、生物發(fā)生和釋放機制的研究不僅可以提高我們對某些疾病的認識，還可以使研究人員更好地針對它們進行治療。外泌體因其天然物質(zhì)運輸性質(zhì)，長期固有的循環(huán)能力和優(yōu)異的生物相容性而具有作為藥物遞送載體的巨大潛力，適合于遞送多種化學品、蛋白質(zhì)、核酸和基因治療劑，以提高靶向準確性，降低最小劑量和不良反應，為診斷和治療創(chuàng)新提供機會。Tan等[58]發(fā)現(xiàn)，外泌體可以在體外促進 Bcl-xL 蛋白表達來抑制乙酰氨基酚和H2O2誘導的肝細胞凋亡。Li等[59]實驗顯示，MSC衍生的外泌體通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變并再將它們直接注射到小鼠纖維化肝臟中保護肝細胞來減輕CCl4誘導的肝纖維化，并且人類MSCs衍生的外泌體在體外對人肝細胞系HL7702顯示出相似的有益作用。Yan等[60]報道，在人類MSC衍生的外泌體中包含谷胱甘肽過氧化物酶1，在肝臟氧化損傷的恢復中起著至關重要的作用，并且Zhang等[61]發(fā)現(xiàn)，其具有類似于MSCs的免疫抑制能力，可以誘導 Treg 細胞和抗炎細胞因子并改善激活的免疫系統(tǒng)。當與外周血單核細胞共培養(yǎng)時，MSCs衍生的外泌體促進調(diào)節(jié)性 T 細胞群的增殖并抑制T細胞增殖[62]。在外泌體中發(fā)現(xiàn)了IL-1β、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β和血管內(nèi)皮生長因子等可以調(diào)節(jié)免疫細胞[63]。人羊膜上皮細胞衍生的外泌體顯著減少肝纖維化過程中巨噬細胞的數(shù)量。從血清中分離的外泌體也已顯示在具有肝纖維化的小鼠中有治療效果，來源于健康小鼠血清的外泌體減少CCl4損傷或硫代乙酸損傷的小鼠肝纖維化，小鼠表現(xiàn)出肝功能改善，肝細胞凋亡減少，受損肝臟炎癥反應抑制，肝臟促炎性細胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-γ 和 TNF-α)釋放減少，炎癥浸潤減少，AST/ALT血清水平降低[35]。上述研究結(jié)果表明，外泌體可以抑制肝細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝纖維化，支持肝細胞功能，促進血管生成，促進肝細胞增殖再生，減少炎癥性損傷。

6 結(jié)語

外泌體攜帶多種分子如 DNA、蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA、lncRNA，在肝內(nèi)進行細胞-細胞間聯(lián)絡，與肝臟的病理生理學密切相關，被視為預測性生物標志物，在肝病診斷、治療及預后中起重要作用，是潛在的治療靶標。病毒性肝炎在肝細胞之間的傳播是通過從感染細胞中釋放含病毒的外泌體來介導的；腫瘤細胞分泌的外泌體可促進腫瘤生長和抗腫瘤免疫反應。在NAFLD或ALD期間從肝細胞獲得的外泌體驅(qū)動巨噬細胞中的活化或趨化性，以及分別在內(nèi)皮細胞或HSCs中的血管生成和活化；來自健康人體的外泌體可以引發(fā)纖維化消退，來自病理狀態(tài)的外泌體促進肝纖維化的發(fā)展；在肝衰竭中，MSCs來源的外泌體可以逆轉(zhuǎn)肝衰竭，促進肝再生。雖然近年來學者們對外泌體的組成、釋放、攝取及功能的理解有所進展，但目前仍有幾個突出的挑戰(zhàn)和問題有待進一步解決：一是大量制備、分離、純化及保存外泌體的方法尚未成熟；二是治療外泌體的正確來源尚不明確；三是關于外泌體在肝臟中生物發(fā)生、釋放、靶向和與靶細胞相互作用的精確分子機制知之甚少。因此，目前需進一步研究解決這些問題更好地利用他們?yōu)榕R床服務。