李笑櫻，孫鐵虎，郭 杰，陳 博，佟 毅，潘喜春

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.吉林中糧生化有限公司（玉米深加工國家工程研究中心），長春 130033；3.中糧集團(tuán)中糧生化專業(yè)化平臺，北京 100005）

真菌毒素是真菌在適宜溫濕度條件和基質(zhì)中產(chǎn)生的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，在糧食及飼料衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域又稱為霉菌毒素[1]。目前已知的霉菌毒素有300多種，其中污染范圍較廣、毒性較大的主要有黃曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬菌素及T2毒素等。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）估算，全世界每年約有25%的谷物受霉菌毒素污染，約2%的農(nóng)產(chǎn)品因霉變而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，給農(nóng)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。被霉菌污染的飼料和糧食顏色、氣味發(fā)生改變，脂肪變質(zhì)，適口性變差，因而動物的采食量下降，影響生長性能；霉菌毒素還會引起動物繁殖功能紊亂，造成繁殖性能降低；降低免疫細(xì)胞活性，導(dǎo)致免疫抑制；還可抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，損害動物的肝腎、腸道、神經(jīng)等器官和組織[3-7]。霉菌毒素在動物產(chǎn)品中（如肉蛋奶中）也會有一定殘留，再通過食物鏈對人體造成危害。因此，早期對飼料及食品中的霉菌毒素進(jìn)行監(jiān)控和防治，從而降低霉菌毒素對畜牧業(yè)的危害、減少經(jīng)濟(jì)損失，對保障消費者身體健康和國家糧食食品安全意義深遠(yuǎn)。我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078-2017）和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）對飼料及原料和食品中各霉菌毒素的最大允許量都制定了嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)。

1 霉菌毒素的檢測方法

霉菌毒素的現(xiàn)有檢測方法主要有兩大類：確認(rèn)方法和快速方法。確認(rèn)方法又叫儀器方法，主要基于理化儀器設(shè)備，如薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和各種聯(lián)用技術(shù)，如氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）等。儀器分析法因其靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠而受到檢測機(jī)構(gòu)的青睞，并作為霉菌毒素的常用確證檢測方法。但這種方法需要較為昂貴的精密設(shè)備，配備專業(yè)的實驗操作人員，且檢測樣本成本高、樣品前處理復(fù)雜、操作步驟煩瑣，無法滿足基層單位對批量樣品的快速篩查檢測的需求。同時，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，糧油食品及飼料相關(guān)的貿(mào)易流通業(yè)務(wù)日益頻繁，各級質(zhì)量控制部門對于樣品檢測的壓力也越來越大，這就要求對霉菌毒素檢測向快捷準(zhǔn)確方向發(fā)展[8-9]。

2 霉菌毒素快速檢測方法

現(xiàn)在較多的快速檢測方法主要基于免疫化學(xué)，包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）和免疫層析方法。酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）的基本原理是將已知的抗原或抗體固定在固相載體上，再用做好標(biāo)記的酶與底物反應(yīng)顯色，以此來判斷是否有相應(yīng)的免疫反應(yīng)[10]。該法的優(yōu)點是免疫反應(yīng)特異性強(qiáng)、靈敏度較高、樣品預(yù)處理簡便，通過酶標(biāo)儀讀取檢測結(jié)果準(zhǔn)確且穩(wěn)定，現(xiàn)已成為最常見的快速檢測飼料和食品中霉菌毒素的方法。

免疫層析法主要通過免疫層析試紙條進(jìn)行檢測，免疫層析試紙條主要由樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊及黏性底板等部分組成。試紙條上NC膜固定有測試線和質(zhì)控線；樣品溶液加入至樣本墊，預(yù)先在結(jié)合墊上噴涂抗體標(biāo)記物，樣品溶液通過毛細(xì)作用在層析試紙條上移動，經(jīng)過檢測線時會發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而游離的抗體標(biāo)記物進(jìn)一步與質(zhì)控線發(fā)生免疫反應(yīng)，已著色的標(biāo)記物在短時間（5～10 min）便可顯示出結(jié)果；測試線的顯色深淺或吸光度大小進(jìn)行定性或半定量判定，檢測結(jié)果往往存在一定誤差。

市面上的免疫層析試紙條標(biāo)記物材料依據(jù)光譜特性的不同可分為兩類：一類是吸收光譜型材料，包括膠體金、膠體碳、磁珠等；另一類是發(fā)射光譜型材料，包括量子點及量子點微球、熒光微球以及上轉(zhuǎn)換磷光納米粒子等，其中膠體金免疫層析法應(yīng)用較為普遍[8]。膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，利用抗原抗體反應(yīng)發(fā)明的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的金溶膠狀態(tài)。利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)或其他多種生物大分子物質(zhì)（如霉菌毒素、抗生素、激素、核酸、多肽綴合物等）的正電荷基團(tuán)的靜電吸引而形成牢固的結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)記物質(zhì)的生物活性卻無顯著影響[11]。

由于霉菌毒素屬半抗原，不具有免疫原性，因此在制備抗體前首先要合成霉菌毒素—載體蛋白結(jié)合物免疫原。由于各種霉菌毒素分子結(jié)構(gòu)不同，其在絕大部分情況下不具備連接反應(yīng)基因，因此霉菌毒素分子首先要經(jīng)過衍生過程，而衍生所需要一定的連接化學(xué)反應(yīng)條件，這種反應(yīng)條件一定不能導(dǎo)致其半抗原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，之后再通過連接物與載體蛋白連接[11]。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA）等。制備好的半抗原結(jié)合物在免疫動物前，要測定結(jié)合物中半抗原數(shù)目，因為結(jié)合物中半抗原分子數(shù)目太多或太少，都會導(dǎo)致誘發(fā)抗體的能力較差。

基于膠體金為標(biāo)記材料的免疫層析法生產(chǎn)的霉菌毒素檢測試紙條是目前應(yīng)用最廣泛的一種快速檢測產(chǎn)品，并已大量應(yīng)用于AFB1、ZEN、DON以及OTA等霉菌毒素的快速檢測。且該技術(shù)由于無需精密儀器、方法簡單快速、成本低廉等優(yōu)點，適用于飼料和糧食現(xiàn)場快檢和大規(guī)模樣品篩查，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[12-14]。

3 霉菌毒素膠體金快速檢測方法在實際中的應(yīng)用

姚佳等以AFB1、DON和ZEN分析了3種毒素膠體金免疫層析快速檢測試紙條的最低檢出限分別為0.005、0.5和0.3 mg·kg-1，通過回收率和變異系數(shù)評價了該快檢方法的準(zhǔn)確性和精密度，并進(jìn)一步將該檢測技術(shù)應(yīng)用于寧夏稻米毒素的快速檢測，結(jié)果表明，3種毒素的膠體金免疫層析快速檢測試紙條具有較高靈敏度和特異性，并可通過肉眼直接判讀結(jié)果的特性，適用于稻米的現(xiàn)場快速檢測[15]。孫清研究了一種可直接檢測油中AFB1的免疫層析方法，其按一定比例混合植物油和純凈水，用免疫層析試紙條檢測，可通過肉眼確認(rèn)油中的AFB1含量，該方法最低檢測限可達(dá)1.5 μg·kg-1，與國標(biāo)法對比其準(zhǔn)確性相對較高[16]。該方法不僅可用于實驗室中糧油AFB1檢測，也可用于家庭中植物油安全檢測。由于近幾年食品安全事件頻發(fā)，牛奶中黃曲霉毒素的快速檢測成為了關(guān)注的重點。Wang等研制出一種用于檢測乳及乳制品中的AFM1的納米金免疫層析試紙條，用該試紙條檢測了15種乳及乳制品中AFM1含量，所需時間僅10 min，檢測限為0.028 ng·mL-1，并檢測出其中6種乳及乳制品受到輕微的AFM1污染，發(fā)現(xiàn)所有樣品中AFM1含量均＜1 ng·mL-1[17]。

以上列舉應(yīng)用多為定性檢測，這些檢測因肉眼觀察主觀性較強(qiáng)，檢測結(jié)果重復(fù)性也相對較差。近年來隨著各種技術(shù)手段綜合應(yīng)用，多學(xué)科之間交叉滲透，膠體金層析快速檢測技術(shù)也有了較大的改進(jìn)和提高。

王海彬成功研制出黃曲霉毒素膠體金免疫層析速測儀，該速測儀結(jié)合光、機(jī)、電、計算機(jī)等技術(shù)手段，膠體金免疫層析試紙條作為一級傳感器，面陣CMOS圖像芯片作為二級傳感器，將黃曲霉毒素免疫層析快速檢測試紙條的定性結(jié)果進(jìn)行快速量化讀取，獲取待檢測黃曲霉毒素的定量信息，從而對黃曲霉毒素進(jìn)行快速定量檢測，檢測花生樣品結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為88%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分布為6%～27%，快速定量檢測結(jié)果與高效液相色譜法比對后發(fā)現(xiàn)兩種方法相對誤差≤17%，同時還建立了花生中黃曲霉毒素總量（B1+B2+G1+G2）的快速定量檢測技術(shù)[18]。張兆城等研發(fā)了花生、玉米、大米、小麥等糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素總量、AFM1和AFB1高靈敏、高特異性系列檢測技術(shù)，同時研制了系列配套試紙條和黃曲霉毒素單光譜成像檢測儀和黃曲霉毒素流動滯后免疫時間分辨熒光檢測儀[19]。王督等研發(fā)的檢測花生、玉米、大米、小麥等糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1的定量分析方法，檢測結(jié)果表明，4種樣品檢測的線性范圍為1.0～20.0 μg·kg-1，r2＞0.97，方法的定量限為1.0 μg·kg-1，樣品加標(biāo)回收率為75%～106%，RSD＜20%，且此法與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對誤差＜15%，樣品檢測時間只需15 min，檢測成本也低于其他方法[12]。

王瑩等通過合成玉米赤霉烯酮（ZEN）人工抗原，制備抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體（mAb），并以此為基礎(chǔ)建立膠體金免疫層析檢測試紙，與膠體金讀數(shù)儀配合使用，用于快速定量檢測玉米和小麥樣品中ZEN，結(jié)果表明，檢測的玉米和小麥樣品，ZEN的檢測限為4.7 μg·kg-1，定量限13.9 μg·kg-1，線性范圍 14.5～500 μg·kg-1，相關(guān)系數(shù) r=0.996 4，用高效液相色譜法進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)快檢方法檢測樣品的準(zhǔn)確度為80.1%～149.7%，變異系數(shù)范圍7.3%～19.6%，并用配對t檢驗分析，表明兩種方法之間無顯著性差異[20]。宋青龍等應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)和定量讀數(shù)儀技術(shù)研制出一種快速定量檢測谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測試劑盒，該試劑盒以膠體金標(biāo)記高特異性單抗，與偶聯(lián)抗原進(jìn)行正交試驗，確定適宜條件，同時通過與對照線和試驗線的顏色對比，應(yīng)用膠體金定量讀數(shù)儀，對樣本中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行定量檢測，結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試劑盒檢測方法便捷、穩(wěn)定，檢測結(jié)果可定量，避免了人眼判別的差異，且與常見霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，樣品檢測結(jié)果與高效液相色譜法檢測結(jié)果的相對誤差＜20%[21]。

對市面上幾款膠體金免疫層析產(chǎn)品進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)品大多也有配套的分析檢測儀，儀器中有樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，可快速讀取檢測樣品中霉菌毒素含量。檢測樣本量沒有特殊要求，既可檢測單個或少量樣本，也可檢測大量樣本。可檢測基質(zhì)成分較為單一的原料樣品（如糧食、油料、飼料原料等）也可檢測基質(zhì)成分較為復(fù)雜的樣本（如酒糟、糧食發(fā)酵產(chǎn)品、成品飼料等），前處理過程安全快捷，無需對檢測提取液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，可用于實驗室霉菌毒素快速檢測。另外，配套的定量檢測儀器可通過網(wǎng)絡(luò)自動進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取、數(shù)據(jù)傳輸、軟件升級、問題故障診斷、質(zhì)量控制等。對使用這些快檢產(chǎn)品的客戶進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)這些快檢產(chǎn)品在實際應(yīng)用中存在一些缺陷；膠體金層析試紙條生產(chǎn)廠家生產(chǎn)過程質(zhì)控不嚴(yán)，讀數(shù)儀對快檢卡顏色深淺不敏感導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差較大，檢測環(huán)節(jié)和快檢卡本身受檢測環(huán)境溫度濕度影響較大，沒有配套完善的儀器確認(rèn)方法，數(shù)據(jù)溯源上傳功能故障頻發(fā)，檢測卡成本過高等，問題還有待解決。

4小 結(jié)

免疫層析試紙條因操作步驟簡便、檢測快速、無需昂貴大型儀器等特點，在批量樣品的快速篩查方面具有極大的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，已廣泛應(yīng)用于糧油及飼料中霉菌毒素的快速檢測[22]。隨著其他新型標(biāo)記材料的應(yīng)用，今后將會進(jìn)一步提高免疫層析方法的檢測準(zhǔn)確性和精確性。另外，霉菌毒素在糧油和飼料中通常多種共存，建立對多種毒素的快速、高通量檢測技術(shù)，將大大節(jié)約成本，提高檢測效率，因此基于免疫層析平臺的多種毒素檢測技術(shù)也必將成為今后的發(fā)展方向之一。霉菌毒素除了在糧食和飼料中存在以外，在其他食品飲品領(lǐng)域（如發(fā)酵類食品、茶葉、菌糠等）同時存在安全隱患，未來對這些領(lǐng)域中霉菌毒素的檢測也應(yīng)該得到重視[23]。各級衛(wèi)生部門和食品安全管理部門應(yīng)重視霉菌毒素的風(fēng)險評估和監(jiān)測預(yù)警等工作，建立霉菌毒素快速檢測標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)管理部門應(yīng)預(yù)防嚴(yán)控食品的來源、加工、銷售等環(huán)節(jié)，精準(zhǔn)掌握其中霉菌毒素數(shù)據(jù)信息，綜合管控治理。同時引導(dǎo)幫助廣大消費者樹立食品安全意識和正確解讀國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)，引導(dǎo)消費者購買安全、健康、綠色的食品[24]。