羅梅 陰偉曉 羅朝喜

摘要 由于殺菌劑的長期大量使用，植物病原菌對殺菌劑抗性問題日趨突出，嚴重影響病害防治的效果。褐腐病是一種在全世界范圍內廣泛發(fā)生和流行的重要果樹病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola為例，基于已知的多菌靈抗性機理，即靶標β微管蛋白基因TUB2的點突變E198A，建立了一種桃褐腐病菌對多菌靈抗性的等位基因?；訮CR檢測技術。結果表明，堿基錯配、內參引物、退火溫度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、?；砸餄舛燃芭浔鹊纫蛩鼐鶎z測效率有影響。經過對以上因素的優(yōu)化，并對優(yōu)化后的檢測技術進行專化性及靈敏度評價，證實該檢測技術能特異性地鑒別桃褐腐病菌M.fructicola對多菌靈抗性基因型E198A，且檢測靈敏度可達到4.342 pg/μL病菌DNA，有望在實踐中推廣使用。

關鍵詞 桃褐腐病菌; AS-PCR; 抗藥性; 多菌靈

中圖分類號： S 436.621.13

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019503

Abstract With the increasing use of fungicides， the fungicide resistance has become a serious problem that affects the effect of fungicides in practice. Brown rot caused by the ascomycete fungus Monilinia fructicola is an important fruit disease that occurs and spreads worldwide. In this study， based on the known resistance mechanism to carbendazim， i.e.， the point mutation E198A of the target β-tubulin gene （TUB2）， an allele-specific PCR （AS-PCR） was developed to detect the carbendazim resistance in M.fructicola. The results showed that the detection efficiency was influenced by mismatch of nucleotides， internal reference gene primer， annealing temperature， dNTPs， Taq DNA polymerase， specific primer concentration and ratio etc. After these factors were optimized， the specificity and sensitivity of the developed AS-PCR were evaluated. The results showed that the AS-PCR could specifically identify the carbendazim-resistant genotype E198A at a sensitivity of 4.342 pg/μL of M.fructicola genomic DNA， which may be widely used in practice.

Key words Monilinia fructicola; allele-specific PCR; fungicide resistance; carbendazim

由褐腐病菌Monilinia spp.引起的桃褐腐病在全世界范圍內廣泛發(fā)生，常對桃產量及品質造成重大影響，嚴重時造成毀滅性損失。在我國引起褐腐病的病原菌主要有3個種，分別為美澳型核果鏈核盤菌Monilinia fructicola、云南叢梗孢Monilia yunnanensis和梅生叢梗孢Monilia mumecola。2005年，M.fructicola第一次在我國報道[1]，之后在北京、浙江、福建、陜西、云南等省市相繼報道，是引起我國桃褐腐病的優(yōu)勢種[2-3]。目前化學防治仍然是防控該病害的主要手段。

苯并咪唑類殺菌劑（MBC類）是20世紀60-70年代開發(fā)出來的一類以苯并咪唑環(huán)為母體的高效廣譜內吸性殺菌劑，在褐腐病的防治中被廣泛使用[4]。其作用機理是與微管蛋白的β亞基結合，干擾微管的組裝，從而破壞紡錘體的形成，影響有絲分裂的進行，導致細胞畸形死亡[5]。但由于其作用位點專一，活性較高，極易產生抗性。目前已發(fā)現(xiàn)β-微管蛋白多個氨基酸突變，如第6位（H6Y）和第198位（E198A）突變分別導致了M.fructicola對MBCs的低抗性（苯菌靈）和高抗性（甲基硫菌靈）[6];E198K[7]，E198Q和F200Y[8]等點突變也能引起M.fructicola對MBCs的高抗性（甲基硫菌靈）[9];第240位突變（L240F）則導致了核果鏈核盤菌Monilinia laxa對MBCs的低抗性（多菌靈）[6]。多菌靈抗性菌株的產生主要是由于靶標β微管蛋白基因TUB2上E198A的點突變所導致，主要表現(xiàn)為第931位核苷酸A突變?yōu)镃[10]。我國關于褐腐病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗性的研究不多，目前僅在北京、山東、云南等省市發(fā)現(xiàn)M.fructicola對甲基硫菌靈和多菌靈產生了抗性（E198A）[10-12]。

單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單個核苷酸變異引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性。等位基因專化性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）是一種簡單、高效的檢測SNP的高通量檢測技術[13]。它主要根據(jù)SNP位點設計特異性引物，其中一條鏈（特異鏈）的3′末端與SNP位點的堿基互補（或相同），另一條鏈（普通鏈）按一般的方法進行設計。特異性引物在一種基因型中有擴增產物，在另一種基因型中沒有擴增產物，從而確定基因型的SNP[14]。AS-PCR操作簡單，成本低，只需要一臺PCR儀和1%瓊脂糖凝膠電泳即可實現(xiàn)檢測目的。經過不斷地改進與完善， 基于SNP的等位基因?；訮CR已逐漸成為一種快速、簡便、低成本、可靠、高通量的檢測基因型SNP的方法，被廣泛使用。

目前已有M.fructicola對MBCs類殺菌劑苯菌靈和甲基硫菌靈的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR檢測報道[6]。2013年，玉蜀黍赤霉Gibberella zeae對MBCs的抗性也是通過設計特異性AS-PCR引物得到了診斷[15]。尚未有M.fructicola對多菌靈抗性（E198A）的分子檢測報道。本文以桃褐腐病菌M.fructicola對多菌靈的E198A抗性菌株為研究材料，開發(fā)出一項能快速檢測桃褐腐病菌對多菌靈抗性的等位基因?；訮CR技術，以期在實踐中對抗性群體進行檢測，監(jiān)測抗性發(fā)生動態(tài)，及時指導病害的防治。

1 材料與方法

1.1 材料

對多菌靈產生抗性（E198A）的桃褐腐病原菌M.fructicola菌株（3株）：YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c，均來自中國云南省紅河哈尼族彝族自治州。對多菌靈敏感的M.fructicola菌株（12株）：ZM09-1a、BM09-4a、HG12-4b、FJC10-7a、HG12-9a、HG12-14b、HG12-20a、HG12-10b、HN13-1a、Bmpc7、MD1-7、MD1-5。其中Bmpc7、MD1-7、MD1-5來自美國南卡羅萊納州，其他菌株來自中國浙江杭州、福建莆田、湖北武漢、北京平谷、云南紅河等不同桃產區(qū)。菌株在PDA培養(yǎng)基上于22℃培養(yǎng)。

DNA聚合酶（Easy Taq DNA polymerase），高純度dNTPs（2.5 mmol/L High Pure dNTPs），10×Easy Taq Buffer，DNA Marker（Trans 2K， Trans 2K Plus）均購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 基因組DNA提取

采用快速提取的方法。取1.5 mL EP管加0.5 mL DNA提取液（1 mol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）。挑20～40 mm2菌絲塊于DNA提取液中，用細胞破碎儀破碎4 min。具體可根據(jù)菌絲生長程度延長破碎時間。12 000 r/min離心10 min，吸上清加入0.3 mL異丙醇。輕輕搖晃混勻幾次，出現(xiàn)絮狀沉淀，12 000 r/min離心10 min。去上清，用0.8 mL 70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，去上清。37℃開口放15 min，使乙醇揮發(fā)。最后加50 μL ddH2O或1×TE溶解DNA。

1.3 引物設計

根據(jù)野生型及抗性突變型菌株的β-微管蛋白基因DNA序列差異，第931位核苷酸堿基的不同（抗性菌株為C，敏感菌株為A），通過Oligo7引物設計軟件設計特異性引物（specific primers，以下簡稱SP）進行抗性區(qū)分（表1）。選用M.fructicola一個非靶標基因MfCCG8設計內參引物（internal reference primers，以下簡稱IP），作為PCR擴增陽性對照。引物由武漢天一輝遠生物公司合成，濃度為10 μmol/L。

1.4 AS-PCR反應程序

以敏感菌株和抗性菌株的基因組DNA為模板，ddH2O為空白對照配制25 μL的PCR反應體系。10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Primer F/R（SPs）各1 μL，Primer F/R（IPs）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，基因組DNA 1 μL （434.2 ng），ddH2O 15.25 μL。反應條件：94℃預變性3 min;94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min，16℃ 1 min。結束后，PCR產物立即用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.5 反應條件及反應體系的優(yōu)化

為了充分提高檢測的特異性及靈敏度，對反應條件及體系充分優(yōu)化。退火溫度：52、54、56、58、60、62℃;dNTPs：0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L;Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：0.5、0.75、1、1.25、15、1.75 U（25 μL體系）。反應體系中各個因素每次只優(yōu)化一個因素，依次進行。優(yōu)化某一因素時，已優(yōu)化參數(shù)參照優(yōu)化后最佳用量，其他參數(shù)設置同1.4。

引物之間會存在模板競爭、試劑競爭，導致擴增效率不一致。通過正交試驗法評價內參引物和特異引物不同濃度梯度以及不同配比對PCR反應擴增效率的影響。引物濃度梯度：0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L;引物配比（IP∶SP）：分別為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.6 AS-PCR的靈敏度及?；詸z測

通過Nanodrop 2000測定抗性菌株（YHC11-8c）的DNA濃度，然后將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10個DNA濃度梯度進行AS-PCR反應的靈敏度評價。另外選取不同來源的桃褐腐病抗性及敏感菌株，以其基因組DNA用于AS-PCR的專化性檢測。

1.7 AS-PCR的實用性檢驗

2×Taq PCR Mix是目前流行的PCR擴增預混液，是將除了模板、引物以外的其他組分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用時直接加入模板和引物即可，操作簡單，節(jié)省時間。本文以2×HieffTM PCR Master Mix（YEASEN）替代Taq DNA聚合酶和dNTPs，以優(yōu)化的退火溫度，最佳引物濃度及比例進行PCR反應，與本文建立的檢測體系作比較。

2 結果與分析

2.1 不同引物對AS-PCR結果的影響

本試驗設計出的針對SNP位點的特異性引物為8CF911和8CR1394。同時為了增強引物的特異性，在特異性引物3′端倒數(shù)第二位/第三位引入不同的錯配堿基，以避免非特異性延伸（表1）。

不同的錯配類型對PCR反應的結果有影響，說明錯配堿基的引入有利于提高引物特異性。引入G-A錯配和G-T錯配的引物無法實現(xiàn)抗/感菌株的區(qū)分且在反復驗證的過程中不穩(wěn)定。引入G-C錯配的引物能夠很好地擴增出抗性菌株基因型，而無法擴增出敏感菌株基因型，條帶亮，結果穩(wěn)定。引入TG-CA錯配的引物組同樣能實現(xiàn)抗性菌株與敏感菌株的區(qū)分，但條帶亮度較弱，擴增效率不高。經比較，選取引入G-C錯配的引物組作為特異性引物（圖1）。

2.2 內參引物對AS-PCR的影響

為指示PCR反應成功與否，特引入了內參PCR引物，擴增片段大小為1 020 bp。測試的兩組內參引物都能較好地擴增出抗性菌株和敏感菌株的DNA，但5-For-MfCCG8/5-Rev-MfCCG8引物組，空白對照和敏感菌株均出現(xiàn)了微弱的假陽性非特異性條帶，重復試驗結果相同。故選擇結果穩(wěn)定、條帶清晰，在陰性對照中不產生非特異性擴增的引物組3-For-MfCCG8/3-Nest-MfCCG8作為內參引物（圖2）。

2.3 AS-PCR反應條件的優(yōu)化結果

退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。理想狀態(tài)下，退火溫度要足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合，因此需確定最佳的退火溫度。結果顯示，不同溫度梯度下，52～58℃均能實現(xiàn)抗性區(qū)分，60～62℃因為溫度過高，模板與引物無法有效退火而無法實現(xiàn)抗性區(qū)分。56℃和58℃條帶亮度很暗，擴增效率較低。52℃和54℃條帶很亮，54℃更接近于兩對引物的Tm值。為保持一致性，保證引物與模板很好地結合以及提高擴增效率，選擇54℃作為最適的退火溫度（圖3）。

2.4 AS-PCR反應體系的優(yōu)化結果

反應體系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑，其質量及濃度是影響PCR反應的擴增效率以及避免產生非特異性擴增的重要因素。dNTPs的優(yōu)化結果表明在設置的各個濃度梯度下反應均能發(fā)生，但特異性引物擴增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L濃度擴增效率相對較高（圖4a）。依據(jù)標準的PCR反應體系中推薦的dNTPs濃度為0.2 mmol/L，本著效率優(yōu)先，節(jié)約為輔的原則，確定dNTPs的最佳濃度為0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的優(yōu)化，在不同的Taq DNA聚合酶濃度下反應均能發(fā)生，但特異性引物擴增的條帶亮度隨濃度增加大致呈依次遞增的關系（圖4b）。結果顯示在Taq DNA聚合酶濃度為1.25 U下擴增的效率已較高，且接近推薦的濃度，故確定Taq DNA聚合酶的用量為1.25 U（25 μL體系）。

2.5 AS-PCR引物比例及引物濃度的優(yōu)化

不同引物的濃度及配比影響PCR反應的擴增效率，不同引物對反應條件以及反應體系存在不同程度的相互競爭導致擴增效率不一致。以抗性菌株YHC11-8c為例，利用正交試驗測試了內參引物和特異引物不同濃度和不同配比下PCR的擴增效率變化。

結果發(fā)現(xiàn)，在引物總濃度≥2.4 μmol/L（圖5c）時，兩種引物對間的相互競爭作用明顯減弱，在不同配比濃度下擴增效率達到了一致。同時發(fā)現(xiàn)在特異性引物與內參引物的比值為4時，這種競爭作用基本被消除。另外通過觀察比較以及計算，發(fā)現(xiàn)內參引物的濃度≥0.266 7 μmol/L（圖5a 4泳道）時，擴增的效率已較高，趨近飽和。特異性引物的濃度≥0.48 μmol/L（圖5c 1泳道）時也能夠達到很高的擴增效率，但容易受到引物間相互競爭作用以及總濃度的限制（圖5a和圖5b）。本著效率優(yōu)先，節(jié)約為輔的原則，確定引物最佳總濃度1.6 μmol/L，IP∶SP的最佳比值為1∶4（25 μL體系）。

2.6 AS-PCR?；詸z測

本試驗使用3個由β-微管蛋白的E198A突變引起的抗性菌株YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c和來自不同地理區(qū)域的12個敏感菌株評價建立的AS-PCR檢測方法的?；浴Ｓ蓤D6可見，該檢測技術可以專一性地從不同來源的敏感菌株群體中檢測出抗性菌株，證明該檢測技術具有較高的特異性，在實踐中有很強的實用性。

2.7 AS-PCR靈敏度檢驗

通過Nanodrop 2000測定抗性菌株YHC11-8c的DNA濃度為434.2 ng/μL，將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10個DNA濃度梯度，進行3次獨立重復試驗。結果發(fā)現(xiàn)該檢測技術的靈敏度很高，最低可從稀釋為10-5（4.342 pg/μL）的病原菌DNA中檢測出抗性菌株，完全可用于生產實踐（圖7）。

2.8 AS-PCR的實用性

如圖8所示，使用Mix體系擴增的PCR反應能夠專一性地擴增抗性菌株基因型，實現(xiàn)抗性區(qū)分，但特異性引物擴增效率偏低，目標條帶較暗（圖8b）?？赡苡捎贛ix是一種混合液，無法針對性地對各個成分進行優(yōu)化。因此，使用Mix的PCR擴增技術雖然簡單方便，但存在局限性，在生產實踐上不及經過充分優(yōu)化開發(fā)出的抗性檢測技術。

3 結論與討論

本研究成功建立了應用于桃褐腐病菌M.fructicola對多菌靈抗性的等位基因?；訮CR檢測技術。研究對反應條件以及反應體系進行優(yōu)化，充分提高了該檢測技術的特異性以及擴增效率。最后對檢測方法進行評價，證明其穩(wěn)定，可靠性強，應用前景廣闊。

桃褐腐病菌對MBCs類殺菌劑產生抗性的現(xiàn)象非常普遍[9]。病原菌在自然界中數(shù)量龐大，抗藥性個體在群體中的比例達到3%時，即可引起抗藥性群體流行，導致藥劑防治失敗。因此開展植物病原菌的抗藥性檢測，能為植物病害的有效防治和抗藥性治理提供實際指導[16]。2013年，Liu等開發(fā)出了玉蜀黍赤霉Gibberella zeae對多菌靈的多個抗性點突變的AS-PCR分子檢測技術[15]。該技術在生產上抗藥性檢測中發(fā)揮了重要作用。近年來，已在不同植物病原真菌中建立了針對MBCs類殺菌劑抗性的相關分子檢測技術[17-18]。同時，也有褐腐病菌M.fructicola對三唑類殺菌劑抗性的分子檢測技術報道[19]。然而到目前為止，國內外尚未有桃褐腐病菌對多菌靈抗性的相關分子檢測報道。

PCR技術作為一項基本分子生物學技術已被廣泛應用到各研究領域中，且隨著發(fā)展需要衍生出各種各樣的PCR方法，如實時熒光定量PCR、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）等，大多比較繁瑣耗時，且價格昂貴，在生產實踐中并不適用[20]。本研究中開發(fā)的等位基因?；訮CR方法， 成本低易操作，僅一臺PCR儀和一對特異性引物即可實現(xiàn)SNP的檢測。與已開發(fā)M.fructicola對MBCs類的苯菌靈和甲基硫菌靈的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR檢測技術相比，對反應體系和反應條件進行了充分優(yōu)化，大大提高了靈敏度（4.342 pg/μL），可以在生產實踐中使用。

通常情況下，對許多聚合酶（包括 Taq DNA聚合酶）來說，引物的3′末端必須與模板完全互補才能產生有效的聚合反應。但在某些情況下，即使引物的3′末端堿基與模板不互補，延伸仍然可以進行，只是延伸效率僅有前者的10-6.6～10-3倍[21]。為避免這種非匹配延伸，引起假陽性，需要在突變點前第二或第三位引入錯配堿基[12]。一個堿基有三種替換方式，不同的替換對PCR的結果有不同影響。參考Little等[21]引入錯配堿基的原則，把堿基之間錯配的不穩(wěn)定性分為4類：T/T、C/T、G/A之間的錯配最不穩(wěn)定，C/C之間錯配的不穩(wěn)定性次之，A/A、G/G 之間錯配的不穩(wěn)定性居中，C/A， G/T 之間的錯配不穩(wěn)定性最弱。引物3′末端堿基的錯配如果是強不穩(wěn)定性，則引入的第二個堿基錯配類型應該用弱不穩(wěn)定性;反之， 則用強不穩(wěn)定性;引物3′末端的錯配如果是中等不穩(wěn)定性，則引入的錯配類型也應用中等不穩(wěn)定性。本研究中引物3′末端的錯配為強錯配（A-C），需引入弱的錯配（G/A）或者不引入錯配。從試驗結果來看，引入G-A錯配（弱錯配）和G-T錯配（強錯配）的引物均無法實現(xiàn)抗性的區(qū)分，敏感菌株和抗性菌株基因型均有條帶出現(xiàn)（圖1）。前者可能是由于A堿基的引入導致引物間Tm值（520℃）差異較大的緣故，以致出現(xiàn)了非特異性擴增;后者或許是不滿足引入錯配的原則，強強錯配反而不穩(wěn)定。引入G-C錯配的引物能夠專一性地擴增出抗性菌株且結果很穩(wěn)定，G-C錯配的引入對Tm值沒有影響，GC含量沒有變化，推測G-C錯配可能是一種中等錯配（圖1，12泳道）。倒數(shù)第三位和第二位分別引入T-C和G-A錯配（均為弱錯配）的引物能實現(xiàn)抗性菌株與敏感菌株的區(qū)分，但條帶亮度較弱，擴增效率不高（圖1，15泳道），符合Little等提出的引入錯配原則。

dNTPs以及Taq DNA聚合酶的各個濃度處理間擴增效率差別并不大，多次重復結果相同（圖4）。用Nanodrop 2000對反應后PCR產物的核酸濃度進行檢測發(fā)現(xiàn)，隨dNTPs濃度增加，擴增產物濃度呈線性遞增的趨勢，說明擴增的效率與dNTPs濃度呈正相關。隨Taq DNA聚合酶濃度增加，擴增產物在1.25 U時達到峰值（圖4）。優(yōu)化過程中擴增效率差別不大的原因或許是dNTPs和Taq DNA聚合酶對擴增效率影響較小。

內參引物和特異引物濃度配比及其他因素對檢測結果存在影響。復合擴增中存在的模板競爭以及試劑競爭等會導致擴增的不平衡。隨著復合擴增位點的增加，引物數(shù)量越來越多， 引物間的相互作用也會導致非特異性擴增， 引物間的最佳濃度配比就成為擴增體系的關鍵因素之一。本實驗通過正交試驗確定了最佳濃度配比（IP∶SP為1∶4）以及最佳濃度用量（1.6 μmol/L）[13]，且發(fā)現(xiàn)引物濃度配比存在某種飽和度，在達到某個值時，將不受競爭作用以及濃度變化的影響，擴增效率達到一致（圖5）。

?；约办`敏度檢測表明，該檢測技術可以專一性地從不同來源的群體中檢測到抗性菌株，且可檢測到DNA的最高稀釋限度為皮克級別，具有很高的特異性及靈敏度，實際生產中適用性強。與使用Mix混合液的PCR反應比較，本試驗建立的高通量AS-PCR檢測技術顯示出更優(yōu)越的適用性及特異性（圖8）。

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