徐飛 王俊美 楊共強(qiáng)

摘要 2015年從河南省田間小麥赤霉病病穗上分離得到一種生長(zhǎng)速度較慢的鐮刀菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子鑒定明確其分類地位，通過(guò)田間單小花滴注法和噴霧法接種測(cè)定其致病力，并通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析對(duì)麥穗中的毒素種類進(jìn)行測(cè)定，明確其產(chǎn)毒特征。結(jié)果表明：分離得到的8個(gè)菌株均為梨孢鐮刀菌，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上為白色菌落，菌落底部產(chǎn)生少量紅色色素，平均生長(zhǎng)速度為13.3 mm/d;小型分生孢子為橢球形葡萄狀，平均大小為7.1 μm×5.8 μm，未見(jiàn)大型分生孢子和厚垣孢子;致病力弱，且不侵染穗軸，單小花滴注法接種條件下平均病級(jí)為0.1，噴霧法接種條件下平均病小穗率為6.5%;供試的8個(gè)鐮刀菌菌株均不產(chǎn)生T-2和HT-2毒素，均產(chǎn)生雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）毒素，NIV毒素含量水平為371.74～5 282.80 μg/kg，其中3個(gè)菌株產(chǎn)生少量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）毒素（86.13～227.22 μg/kg）。

關(guān)鍵詞 小麥; 小麥赤霉病; 梨孢鐮刀菌; 雪腐鐮刀菌烯醇

中圖分類號(hào)： S 435.121.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019483

Abstract In 2015， eight slow-growing Fusarium strains were isolated from the diseased wheat heads with Fusarium head blight in the field in Henan province. The species status was identified by morphological and molecular characters. The pathogenicity of these isolates was determined by the single-spikelet point inoculation and spray inoculation， and the toxin types of these isolates in wheat heads were determined by HPLC/electrospray ionization tandem mass spectrometry system. The results showed that all the eight isolates were Fusarium poae， with white colonies on PDA and a small amount of red pigments produced at the bottom of the colony. The average growth rate of these isolates was 13.3 mm/d. The average size of microconidia was 7.1 μm×5.8 μm， globose and napiform， without macroconidia and chlamydospores. The pathogenicity of these isolates was weak， and they did not infect the spike axis. The average disease level was 0.1 under the single-spikelet point inoculation. The average spikelet rate was 6.5% under the spray inoculation. These isolates did not produce T-2 and HT-2， but all of them produced nivalenol （NIV）. The level of NIV was 371.74-5 282.80 μg/kg， and three isolates produced a small amount of deoxynivalenol （DON） （86.13-227.22 μg/kg）.

Key words wheat; Fusarium head blight; Fusarium poae; nivalenol

由鐮刀菌引起的小麥赤霉病不僅能造成產(chǎn)量損失，而且病原菌產(chǎn)生毒素污染籽粒，造成人畜中毒[1]。禾谷鐮刀菌復(fù)合群Fusarium graminearum species complex，黃色鐮刀菌F.culmorum和燕麥鐮刀菌F.avenaceum是分布廣泛的主要致病種，而梨孢鐮刀菌F.poae也是引起小麥赤霉病的重要病原之一[2]。梨孢鐮刀菌不僅能產(chǎn)生B型非大環(huán)類單端孢霉烯族類毒素，包括雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-acetyldeoxynivalenol，3ADON）及15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-acetyldeoxynivalenol，15ADON），還能產(chǎn)生A型非大環(huán)類單端孢霉烯族類毒素，包括T-2毒素和HT-2毒素[3]。由于梨孢鐮刀菌產(chǎn)毒種類多，且在不同地域或氣候條件下產(chǎn)生不同的毒素[3]，而我國(guó)梨孢鐮刀菌產(chǎn)毒情況未見(jiàn)報(bào)道，因此我國(guó)的梨孢鐮刀菌的產(chǎn)毒情況仍需研究。

近年來(lái)，梨孢鐮刀菌在阿根廷、加拿大、德國(guó)和意大利等國(guó)家的小麥上分離頻率增加[4-5]。在我國(guó)僅湖北報(bào)道4個(gè)菌株為梨孢鐮刀菌[6]，之后未有報(bào)道。本研究旨在明確河南省梨孢鐮刀菌的分布和產(chǎn)毒種類。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

供試鐮刀菌的小麥病穗樣本于2015年采集自河南省新鄉(xiāng)市獲嘉縣（35°3′45″N， 113°37′51″E， 海拔82.8 m和35°3′44″N， 113°37′51″E， 海拔79.5 m）和濮陽(yáng)市濮陽(yáng)縣（35°32′3″N， 115°13′54″E， 海拔53.1 m）的小麥-水稻連作地塊。

1.2 病原菌的分離純化和形態(tài)學(xué)鑒定

將樣品中發(fā)病的小穗剪下，剪掉麥芒，在超凈工作臺(tái)里分別在70%乙醇中處理10 s，3%NaClO中消毒1 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次;用滅菌的濾紙片吸干水分并在工作臺(tái)中吹干;最后將病組織置于含有抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，150 μg/mL硫酸鏈霉素和 75 μg/mL氨芐青霉素鈉鹽）上，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d，待病組織周圍長(zhǎng)出類似鐮刀菌菌落后，挑取至新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個(gè)發(fā)病的麥穗分離1個(gè)菌株。隨后連續(xù)3次挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化獲得純化菌株。將分離得到8個(gè)菌株的菌絲塊分別放入20%甘油-75℃凍存。

將收集來(lái)的康乃馨葉片制作康乃馨葉片培養(yǎng)基[7]，制作方法為將葉片沖洗干凈后，再用無(wú)菌水沖洗，剪成約10 mm×10 mm的小塊，放入錫箔紙中包裹，在70℃條件下烘干3 h。在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中倒入滅菌的2%水瓊脂培養(yǎng)基，凝固后用無(wú)菌的鑷子將6塊烘干的康乃馨葉片放在培養(yǎng)基上。將各純化菌株挑取至康乃馨葉片培養(yǎng)基中間，在25℃條件下，12 h黑暗12 h光照條件下培養(yǎng)7～14 d。挑取葉片邊緣的分生孢子進(jìn)行顯微觀察，測(cè)量并記錄其大小。每個(gè)菌株記錄20個(gè)孢子并計(jì)算其平均值。比對(duì)鐮刀菌鑒定手冊(cè)中的孢子大小進(jìn)行初步鑒定[7]。

1.3 分子鑒定

將各菌株用挑針轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌牙簽挑取氣生菌絲50～100 mg裝在2 mL的離心管中。然后用液氮速凍，存放在-20℃的冰箱里待用。每個(gè)2 mL的離心管加入5顆直徑2 mm的鋼珠（提前加入試劑盒中提取液300 μL），使用德國(guó)萊馳球磨儀（MM400）30次/s振蕩2 min，然后加入試劑盒中提取液200 μL，使用E.Z.N.A.TM HP Fungal DNA Kit （OMEGA， 貨號(hào)：D3195）按提取步驟進(jìn)行DNA提取。DNA提取后，置于1.5 mL的離心管中于-20℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增8個(gè)菌株的EF-1α基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定其種類，PCR引物和程序參考ODonnell等[8]和Proctor等[9]。引物EF1 （5′-ATGGGTAAGGA（A/G）GACAAGAC-3′）和EF2 （5′-GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT-3′）用來(lái)擴(kuò)增EF-1α基因部分序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。然后使用特異性引物Fp82F（5′-CAAGCAAACAGGCTCTTCACC-3′）和 Fp82R（5′-TGTTCCACCTCAGTGACAGGTT-3′）進(jìn)行特異性檢測(cè)，進(jìn)一步明確其種類[10]。

1.4 致病力測(cè)定

將-75℃凍存的鐮刀菌菌株在新鮮的PDA平板上活化，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，打取5塊（5 mm）邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)接到裝有羧甲基纖維素酯培養(yǎng)基（CMC）（carboxymethyl-cellulose 150 g/L， NH4NO3 1.0 g/L， KH2PO4 1.0 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 酵母提取物1.0 g/L）的小三角瓶（100 mL），25℃，150 r/min搖培3～7 d，待產(chǎn)生大量分生孢子后，分別將供試菌株的分生孢子懸浮液經(jīng)擦鏡紙過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)濾液中分生孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL和1×106個(gè)/mL分別用于單小花滴注接種和噴霧接種。禾谷鐮刀菌對(duì)照菌株15HJ1-12用相同的方法獲得分生孢子，其單小花滴注接種的分生孢子濃度為5×105個(gè)/mL。

于小麥品種‘周麥18揚(yáng)花初期（2016年5月3日），采用單小花滴注法和噴霧法兩種方法分別接種。單小花滴注法采用剪刀剪去麥穗中部小穗的內(nèi)外穎殼頂部少許，滴入鐮刀菌分生孢子懸浮液20 μL，每個(gè)麥穗接種1個(gè)小穗，每個(gè)品種接種30穗，10穗為1個(gè)重復(fù)，分別套透明塑料袋保濕，并記錄接種后的天氣情況，2 d后去掉保濕袋，接種后第10 天分別記錄每穗的病級(jí)，病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《小麥抗病蟲性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 第4部分：小麥抗赤霉病評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（NY/T 1443.4-2007）[11]中單小花滴注法的嚴(yán)重度分級(jí)來(lái)進(jìn)行調(diào)查記載，平均病級(jí)=調(diào)查穗總病級(jí)/總調(diào)查穗數(shù);噴霧法接種采用鐮刀菌分生孢子懸浮液噴霧，每平方米噴霧50 mL，每個(gè)品種接種30穗，10穗為1個(gè)重復(fù)，分別套透明塑料袋保濕，接種后第10天分別記錄每穗的病小穗數(shù)和總小穗數(shù)，并計(jì)算病小穗率，接種后10 d的病小穗率=病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%。小麥成熟后，將噴霧法接種的病穗分別裝入網(wǎng)袋，晾干后4℃冰箱中保存，以進(jìn)行后續(xù)的麥穗組織毒素種類和含量測(cè)定。

1.5 毒素種類測(cè)定

將收回的麥穗剪碎，然后使用德國(guó)萊馳粉碎儀（ZM200， 1.5 mm不銹鋼環(huán)篩）進(jìn)行粉碎，過(guò)20目篩裝入不同的自封袋中備用。每個(gè)樣品粉碎后，嚴(yán)格清理以避免相互污染。寄往江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析進(jìn)行產(chǎn)毒類型和產(chǎn)生量分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

在25℃黑暗條件下，8個(gè)菌株在PDA上菌落為白色，底部能產(chǎn)生少量紅色色素，生長(zhǎng)速度為12.0～14.3 mm/d（平均為13.3 mm/d）;其小型分生孢子呈橢球形，葡萄狀，多數(shù)無(wú)分隔，偶見(jiàn)1個(gè)分隔，大小為（6.3～7.9）μm×（5.4～6.2）μm（平均為7.1 μm×5.8 μm），未見(jiàn)大型分生孢子和厚垣孢子（圖1，表1）。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與梨孢鐮刀菌相符。

2.2 分子鑒定

通過(guò)EF-1α基因序列測(cè)定，整合后在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明：8個(gè)菌株的序列（登錄號(hào)為：KX298968～KX298972， KX298974～KX298976）與DNA序列庫(kù)中登錄號(hào)為MG889924和KP639705的梨孢鐮刀菌的EF-1α基因序列同源性為100%。通過(guò)特異性引物Fp82F/R擴(kuò)增，電泳后均產(chǎn)生0.22 kb的條帶，再次確認(rèn)8個(gè)菌株為梨孢鐮刀菌。

2.3 致病力測(cè)定和再分離結(jié)果

供試的8個(gè)鐮刀菌菌株接種后保濕2 d的條件下，單小花滴注法接種10 d后，70%～90%的接種小穗不發(fā)病，10%～30%的接種小穗能夠產(chǎn)生明顯褐變，且不侵染至穗軸，8個(gè)鐮刀菌菌株的平均病級(jí)為0.1～0.3（平均為0.1）。禾谷鐮刀菌對(duì)照菌株15HJ1-12的平均病級(jí)為1.2。噴霧法接種10 d后，小穗能產(chǎn)生明顯褐變，但不侵染穗軸，病小穗率為1.6%～15.8%（平均為6.5%）。將噴霧法接種后的發(fā)病小穗按照菌株分別取樣，每個(gè)菌株3個(gè)小穗，進(jìn)行組織分離，分離得到白色菌落菌株，并用裝50 mL CMC進(jìn)行搖培，得到橢圓形葡萄狀小型分生孢子，因此確定為梨孢鐮刀菌（圖1，表1）。

2.4 毒素種類測(cè)定

供試的8個(gè)鐮刀菌菌株均不產(chǎn)生T-2和HT-2毒素，均產(chǎn)生NIV毒素，NIV毒素含量水平為371.74～5 282.80 μg/kg。另外，8個(gè)菌株中，只有菌株15PY4-4產(chǎn)生ZEN毒素（20.12 μg/kg）;4個(gè)菌株不產(chǎn)生DON、3ADON和15ADON毒素;3個(gè)菌株（15PY4-4、15HJ4-49和15HJ4-13-1）產(chǎn)生DON毒素（86.13～227.22 μg/kg），2個(gè)菌株（15HJ4-13-1和15PY4-4）產(chǎn)生3ADON毒素（58.64、159.23 μg/kg），3個(gè)菌株（15PY4-4、15HJ3-53和15HJ4-13-1）產(chǎn)生15ADON毒素（29.11～293.14 μg/kg）（表1）。

3 結(jié)論與討論

河南省小麥赤霉病菌主要是禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌[13]，而梨孢鐮刀菌較少。單小花滴注接種條件下，梨孢鐮刀菌（平均病級(jí)為0.1）致病力比禾谷鐮刀菌（平均病級(jí)為1.2）弱，且不侵染穗軸。梨孢鐮刀菌致病力極弱，可能是其沒(méi)有在中國(guó)大面積發(fā)生的原因。但是Audenaert等[14]發(fā)現(xiàn)三唑類殺菌劑（戊唑醇、丙硫菌唑、氟環(huán)唑和葉菌唑）防治小麥赤霉病造成梨孢鐮刀菌的比例上升。隨著我國(guó)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈抗性的升高，戊唑醇已經(jīng)成為防治小麥赤霉病的主要藥劑，并且丙硫菌唑及其復(fù)配藥劑已在中國(guó)登記并使用。因此監(jiān)測(cè)梨孢鐮刀菌在中國(guó)的流行對(duì)我國(guó)小麥赤霉病的防治具有重要意義。

河南省梨孢鐮刀菌主要分布在新鄉(xiāng)市獲嘉縣的紅旗渠和濮陽(yáng)市濮陽(yáng)縣的沿黃稻-麥連作田塊中，可能原因是梨孢鐮刀菌更喜歡濕潤(rùn)的環(huán)境[15]。河南省梨孢鐮刀菌主要產(chǎn)生雪腐鐮刀菌烯醇毒素，不產(chǎn)生T-2和HT-2毒素，與阿根廷菌株一樣[5]，而與挪威菌株產(chǎn)生HT-2毒素不一樣[16]。本研究首次在河南省發(fā)現(xiàn)梨孢鐮刀菌，其主要分布在沿黃稻麥連作區(qū)，致病力弱并主要產(chǎn)生雪腐鐮刀菌烯醇毒素，為梨孢鐮刀菌的監(jiān)測(cè)流行提供有利信息。

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（責(zé)任編輯：田 喆）