胡巧云，姜利霞,2，何世成，唐小明，林 源，彭 志，王衛(wèi)國(guó),王昌建※

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410128）

鴿毛滴蟲(chóng)病又稱(chēng)口腔潰瘍癥，亦稱(chēng)為“鴿癀”，是一種由毛滴蟲(chóng)引起侵害鴿消化道上段的原蟲(chóng)病。以鴿口腔、咽喉及上消化道形成粗糙黃色干酪樣的沉著物為主要特征，導(dǎo)致病鴿口腔不能完全閉合，黃白色分泌物阻塞上消化道和呼吸道，繼而消瘦或窒息死亡。乳鴿最易感染發(fā)病，感染死亡率高達(dá)80%以上。成年鴿感染率較低，可能攜帶但不表現(xiàn)臨床癥狀。鴿毛滴蟲(chóng)的感染常常與飼養(yǎng)條件相關(guān)，飼養(yǎng)密度高環(huán)境惡劣可能出現(xiàn)毛滴蟲(chóng)病的爆發(fā)，造成養(yǎng)殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。

本次案例診斷主要對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)送來(lái)的5只病鴿，進(jìn)行了解剖、病理觀察、原蟲(chóng)觀察、細(xì)菌分離，并對(duì)干酪樣物進(jìn)行了毛滴蟲(chóng)基因的擴(kuò)增和測(cè)序，現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室診斷過(guò)程如下：

1 發(fā)病情況

花垣縣一養(yǎng)殖場(chǎng)12萬(wàn)羽種鴿，品種為新白卡、石岐鴿。從2020年7月中旬起，陸續(xù)有幼鴿發(fā)病，至8月初累計(jì)至發(fā)病100只。發(fā)病日齡均為17～25日齡，病程為7～10日。病鴿表現(xiàn)為呼吸困難、消瘦、脖子腫大、喉管內(nèi)有黃色干酪樣物質(zhì)（如圖1），拉黃綠色稀便。用過(guò)強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、阿莫西林、恩諾沙星等藥物未有效果。一年免疫兩次新城疫苗，其余疫苗都未免疫。

2 病理解剖

對(duì)送檢5只病鴿進(jìn)行了解剖，取樣。病鴿口腔和咽喉有粘液，喉管內(nèi)和食道黏膜表面附著黃色干酪樣物質(zhì)（如圖1），嗉囊黏膜粗糙不平，喉頭無(wú)明顯病變，氣管有環(huán)狀出血現(xiàn)象。肌肉無(wú)明顯病變，心包腔內(nèi)有黃色積液，氣囊有黃色纖維素性滲出物。肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、腺胃都無(wú)明顯病變。肌胃內(nèi)膜呈綠色，內(nèi)容物呈綠色，剝離內(nèi)膜內(nèi)壁無(wú)明顯病變。腸、胰臟無(wú)明顯病變，法氏囊水腫，腦無(wú)明顯病變。

圖1 病鴿的典型癥狀

3 毛滴蟲(chóng)的鏡檢與基因擴(kuò)增測(cè)序

3.1 毛滴蟲(chóng)鏡檢觀察

將1.5 mL離心管中加入0.5 mL生理鹽水，用棉簽刮取病鴿口腔和咽部黃色干酪樣物質(zhì)，打開(kāi)離心管，將樣本拭子放入其中，并浸入生理鹽水中，密封寫(xiě)好編號(hào)記錄，打開(kāi)樣本離心管，取拭子樣本涂抹于載玻片上，蓋上蓋玻片，置光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀察?？梢?jiàn)灰白色梨型或橢圓形的蟲(chóng)體，鐘擺狀不停運(yùn)動(dòng)，蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)迅速，活性非常強(qiáng)（如圖2箭頭所示）。

圖2 干酪樣物質(zhì)用生理鹽水懸浮后觀察到的毛滴蟲(chóng)

3.2 毛滴蟲(chóng)E2基因的引物合成與測(cè)序

3.2 .1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)毛滴蟲(chóng)（Trichomonas gallinae）的黏附因子（AP65-1） 基因序列(NCBI Genebank登錄號(hào):KJ721787.1)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物（Pf：5’-CCTTCTCCCATACAAGGTCTTC-3’,Pr：5’-GCGGTCTGTACCCATATCTAAC-3’），預(yù)期擴(kuò)增大小為475bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 .2 干酪樣物的核酸提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析取鴿干酪樣物質(zhì)0.1g加入EP管中，加生理鹽水至200μL，至全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸，再用提取的核酸作為模板，配制反應(yīng)體系，至PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃ 變性10s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35個(gè)循環(huán)；95℃延伸10 min。

擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的特異性片段，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3。凝膠回收后，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBIblast比對(duì)，該基因片段與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中17條序列有較高的同源性，均為滴蟲(chóng)屬（Trichomonas），主要為陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis）的粘附蛋白AP65-2、禽毛滴蟲(chóng)（Trichomonas gallinae）的黏附蛋白AP65-1，同源性為95.83%～97.05%。這表明該樣品中存在毛滴蟲(chóng)同源性較高的核酸，為鴿毛滴蟲(chóng)的診斷提供了依據(jù)。

圖3 毛滴蟲(chóng)ap65-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 細(xì)菌分離結(jié)果

用接種環(huán)取5只病鴿口腔、咽部的黃色干酪樣物質(zhì)，病鴿心血、肝、肺、腎分別接種于含有5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基和鮮血瓊脂平板上，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48h。

挑取部分相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落，進(jìn)一步劃線(xiàn)純化，然后挑取菌落革蘭氏染色,再經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定。細(xì)菌分離結(jié)果是，5只鴿子的干酪樣物質(zhì)接種的平皿都長(zhǎng)出很多的菌，說(shuō)明干酪樣物質(zhì)里的含菌量非常高，是細(xì)菌叢生的地方。4只鴿子肝臟中都能分離到一種白色粗糙菌落，3只鴿子組織中沒(méi)有分離到菌，兩只鴿子血液中分離到不同的菌落。經(jīng)染色和鑒定，干酪樣物質(zhì)較優(yōu)勢(shì)的菌為大腸桿菌，肝臟分離到的為革蘭氏陽(yáng)性（G+）棒狀芽孢桿菌，血液中分離到葡萄球菌。在發(fā)病嚴(yán)重的鴿子組織樣品中也發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌感染，沒(méi)有分離到一種優(yōu)勢(shì)致病菌。

綜合鴿子的發(fā)病情況、臨床癥狀、解剖情況以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，判定此病例是由鴿毛滴蟲(chóng)引起主要癥狀，并有混合細(xì)菌感染引起鴿群的發(fā)病和死亡。

5 治療及飼養(yǎng)管理建議

5.1 及時(shí)給藥治療

發(fā)現(xiàn)病鴿和帶蟲(chóng)鴿應(yīng)隔離飼養(yǎng)，在飼料中添加抗滴蟲(chóng)藥物，0.5%制霉菌素，飲水中添加0.01%甲硝唑，發(fā)病嚴(yán)重的鴿子注射甲硝噠唑。用0.05%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行全群預(yù)防。對(duì)已除去干酪樣沉積物的咽喉潰瘍面，用10%碘甘油或金霉素油膏涂于表面。

5.2 徹底消毒

發(fā)病鴿帶蟲(chóng)鴿，及時(shí)隔離治療，死亡鴿子進(jìn)行無(wú)害化處理。對(duì)于污染的鴿舍，清掃干凈，對(duì)鴿舍、環(huán)境和接觸的器具用石灰乳、火堿來(lái)蘇爾等進(jìn)行消毒。

5.3 飼養(yǎng)管理

分群飼養(yǎng)防止疫病傳播，注意合適的飼養(yǎng)密度。不同年齡段的鴿子分群飼養(yǎng)，新引種的鴿子先隔離觀察，保證沒(méi)有疫病再引入鴿舍。注意鴿舍衛(wèi)生清潔，防止疫病滋生。鴿群環(huán)境不好，免疫力低下加重毛滴蟲(chóng)的發(fā)生。定期檢查口腔毛滴蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)采取措施，隔離治療。

經(jīng)過(guò)以上一系列措施執(zhí)行后，該鴿場(chǎng)鴿群疫病明顯好轉(zhuǎn)。