姜碩　許哲祥　吳桐　鄭春英

摘要 [目的]研究鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗活性成分變化規(guī)律，探討其與組培苗生長(zhǎng)的相關(guān)性。[方法]分別采用比色法和HPLC法對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖和黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中活性成分也不斷增長(zhǎng)，二者呈現(xiàn)出正相關(guān)性。[結(jié)論]采用活性成分含量測(cè)定方法可監(jiān)測(cè)鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛;組織培養(yǎng)苗;多糖;黃酮;變化規(guī)律

中圖分類號(hào) R 931文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0218-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.056

Study on the Variation of Active Compounds in the Tissue Culture Seedling of Dendrobium offcinale

JIANG Shuo1，2， XU Zhe-xiang1，2， WU Tong1，3 et al

（1. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University， Harbin，Heilongjiang 150500;2. Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences， Heilongjiang University， Harbin，Heilongjiang 150080;3. Key Laboratory of Molecular Biology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective]The variation of active compounds in the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale was studied in order to analyze the relation with the growth of the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale.[Method]Colorimetric method and HPLC method were used to determine the content of polysaccharides and flavones in tissue culture seedlings of Dendrobium officinale at different culture time.[Result]With the increase of the cultivation time， the active ingredients in the tissue culture seedlings of Dendrobium offcinale also increased， and the two showed a positive correlation. [Conclusion] The quality of the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale can be evaluated by determination of the active compounds.

Key words Dendrobium offcinale;Tissue culture seedling;Polysaccharide;Flavone;Variation

鐵皮石斛，蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium offcinale Kimura et Migo）的干燥莖[1]，藥食兩用名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[2]，含有多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等多種活性成分[3]，具有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等活性作用。近年來，由于過度開采及各種環(huán)境因素的改變，使得鐵皮石斛成為瀕危藥用植物，現(xiàn)被收錄于《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》[7]。

為了快速滿足大眾消費(fèi)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其快速生產(chǎn)繁育能力及工廠化生產(chǎn)能力，現(xiàn)已成為解決鐵皮石斛資源短缺的最有效途徑[8]。鑒于植物組織培養(yǎng)技術(shù)在鐵皮石斛生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，筆者以多糖和黃酮含量為指標(biāo)，比較不同培養(yǎng)時(shí)期鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中活性成分的動(dòng)態(tài)積累情況，為高質(zhì)量提高鐵皮石斛組織培養(yǎng)的生產(chǎn)能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

1/2MS培養(yǎng)基[9]。

鐵皮石斛原球莖，泉州正和堂生物科技有限公司惠贈(zèng);葡萄糖對(duì)照品（美國(guó) Sigma 公司）;蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定院）。甲醇為色譜純級(jí)別，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200型高效液相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）;752分光光度計(jì)（上海廣譜儀器有限公司）。

1.3 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖的動(dòng)態(tài)變化

1.3.1 供試品溶液的制備。

分別取不同培養(yǎng)時(shí)間的鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗，烘干，精密稱取0.5 g，加水溶解（料液比為1∶10），以50 ℃超聲提取45 min，過濾，重復(fù)提取2次，合并濾液，以50 ℃減壓濃縮至5 mL左右，加入95%乙醇溶液使醇濃度達(dá)到80%，放置過夜，棄去上清液，3 000 r/min離心5 min，將沉淀烘干。分別精密稱取0.3 g，加水定容至1 mL，作為多糖供試品溶液，備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備。

精密稱取葡萄糖對(duì)照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL），備用。

1.3.3 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

參照文獻(xiàn)[10]，采用蒽酮-硫酸法，測(cè)定其在625 nm處的吸光度。以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.571 4x+0.011 8（r=0.999 1），表明葡萄糖對(duì)照品在0.1～0.5 mg/mL線性關(guān)系較好。

1.3.4 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖的動(dòng)態(tài)變化。

參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.4 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中黃酮的動(dòng)態(tài)變化

1.4.1 色譜條件。

色譜柱為Venusil XBP-C18柱;流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50）;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.4.2 供試品溶液的制備。

分別取不同培養(yǎng)時(shí)間的鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗，烘干，精密稱取0.2 g，加入95%乙醇（料液比1∶30），以50 ℃超聲提取45 min，過濾，重復(fù)提取3次，合并濾液，在50 ℃條件下減壓濃縮至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液，備用。

1.4.3 對(duì)照品溶液的制備。

精密稱取蘆丁對(duì)照品0.2 mg，加入適量色譜甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

1.4.4 蘆丁對(duì)照品線性關(guān)系考察。

取不同濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，各吸取 10 μL 注入HPLC中，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=9 924 681x+22 764（r=0.999 8），最低檢出質(zhì)量濃度（以S/N≥3計(jì)）為0.6 μg/mL，表明蘆丁在0.06～0.30 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

1.4.5 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中黃酮的動(dòng)態(tài)變化。

將“1.4.2”中各供試品溶液注入HPLC，以“1.4.1”色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 多糖測(cè)定方法學(xué)考察。

精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、葡萄糖對(duì)照品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.95%、1.32%和1.97%;平均加樣回收率為98.82%，RSD為3.01%。

2.1.2 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖的動(dòng)態(tài)變化。

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中多糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的培養(yǎng)過程中，在7～28 d的培養(yǎng)階段，多糖含量顯著增長(zhǎng)，表明鐵皮石斛培養(yǎng)苗在此階段處于生長(zhǎng)旺盛期;在28～42 d的培養(yǎng)過程中，多糖含量處于緩慢增長(zhǎng)的過程。由此說明，培養(yǎng)時(shí)間與多糖含量呈正相關(guān)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，其多糖含量也呈現(xiàn)不斷積累的過程，但達(dá)到一定的培養(yǎng)時(shí)間后，其多糖含量增長(zhǎng)減慢并會(huì)隨著組織培養(yǎng)苗的成熟而達(dá)到平穩(wěn)的程度。

2.2 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中黃酮的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 黃酮測(cè)定方法學(xué)考察。

精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、蘆丁對(duì)照品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.68%、0.82%和1.56%;平均加樣回收率為99.06%，RSD為2.47%。

2.2.2 鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中黃酮的動(dòng)態(tài)變化。

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗中蘆丁進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2～3。 從圖2～3可以看出，在鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的培養(yǎng)過程中，在7～21 d的培養(yǎng)階段，蘆丁含量處于增長(zhǎng)的狀態(tài);在21～28 d的培養(yǎng)階段，蘆丁含量顯著增長(zhǎng)，表明鐵皮石斛培養(yǎng)苗在此階段處于生長(zhǎng)旺盛期;在28～42 d的培養(yǎng)過程中，蘆丁含量處于平穩(wěn)增長(zhǎng)的過程。由此說明，培養(yǎng)時(shí)間與蘆丁含量也呈正相關(guān)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，其蘆丁含量也呈現(xiàn)不斷積累的過程，但達(dá)到一定的培養(yǎng)時(shí)間后，其蘆丁含量增長(zhǎng)減慢并會(huì)隨著組織培養(yǎng)苗的成熟而達(dá)到平穩(wěn)的程度。

3 結(jié)論

該研究采用多糖和黃酮含量為指標(biāo)監(jiān)控鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)，并通過上述2種成分的動(dòng)態(tài)積累過程描述鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的質(zhì)量，結(jié)果表明，鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗的品質(zhì)可以替代人工栽培，該結(jié)果可為解決鐵皮石斛資源緊缺提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] DING J T，TU H Y，ZANG Z L，et al.Precise control and prediction of the greenhouse growth environment of Dendrobium candidum[J].Computers and electronics in agriculture，2018，151：453-459.

[2] WANG M Y，SHEN C，AN M F，et al.Combined treatment with Dendrobium candidum and black tea extract promotes osteoprotective activity in ovariectomized estrogen deficient rats and osteoclast formation[J].Life sciences，2018，200：31-41.

[3] CUI H Y，MURTHY H N，MOH S H，et al.Protocorm culture of Dendrobium candidum in balloon type bubble bioreactors[J].Biochemical engineering journal，2014，88：26-29.