施秀　張婷婷　貢成良　曹廣力　薛仁宇　張星　胡小龍

摘要 [目的] 探討異育銀鯽在維氏氣單胞菌感染的條件下腎臟組織基因表達譜。[方法]運用RNA-sequencing技術分析健康和感染維氏氣單胞菌的異育銀鯽腎臟組織中mRNA表達水平的變化。[結(jié)果] 通過比較維氏氣單胞菌感染組與健康對照組異育銀鯽腎臟組織基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌感染后11 567個基因表達水平發(fā)生了顯著變化，其中5 634個基因表達水平發(fā)生上調(diào)，5 933個基因表達水平發(fā)生下調(diào)。對所有差異表達基因（DEGs）進行功能注釋（GO）分析，發(fā)現(xiàn)1 325個DEGs含有GO注釋，其中上調(diào)和下調(diào)表達基因分別為581和744個;GO注釋結(jié)果顯示，上調(diào)表達基因主要富集于RNA指導的DNA聚合酶活性、Ⅱ型特異性脫氧核糖核酸酶活性、內(nèi)切酶活性等;下調(diào)表達基因主要富集于吡哆醛結(jié)合、肽酶抑制劑活性和RNA指導的DNA聚合酶活性等。對所有DEGs進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)545個DEGs（215個上調(diào)表達基因，330個下調(diào)表達基因）含有KEGG注釋;上調(diào)表達基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、抗原加工和呈現(xiàn)和雌激素信號通路等KEGG通路;下調(diào)表達基因富集通路主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞黏附分子和jak-STAT信號通路等KEGG通路。對差異表達基因進行熒光定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)其與RNA-sequencing結(jié)果具有相似的表達趨勢。[結(jié)論] 這些研究結(jié)果可為后續(xù)解析異育銀鯽對A.veronii感染的發(fā)病機制提供參考數(shù)據(jù)。

關鍵詞 維氏氣單胞菌;異育銀鯽;表達譜

中圖分類號 S 943文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）23-0131-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.032

Gene Expression? Pattern Analysis of Carassius auratus gibelio Infected by Aeromonas veronii

SHI Xiu， ZHANG Ting-ting， GONG Cheng-liang et al

（School of Biology & Basic Medical Sciences， Soochow University， Suzhou， Jiangsu 215123）

Abstract [Objective] The purpose of this study was to explore the mRNA expression pattern in the kidney tissues of Carassius auratus gibelio infected by? Aeromonas veronii. [Method] RNA-sequencing was applied to analyze the gene expression pattern in the kidney tissues of healthy C. auratus gibelio and C. auratus gibelio infected by A. veronii. [Result] Through comparing the gene expression differences of kidney tissues of C. auratus gibelio in healthy group and A. veronii infection group， it was found that the expression level of 11 567 genes had significant changes， 5 634 genes were up-regulated and 5 933 genes were down-regulated .Through functional annotation （GO） analysis of all differentially expressed genes （DEGs）， it was found that 1 325 in all DEGs had GO terms， containing 581 up-regulated genes and 744 downregulated genes. GO annotation results showed that? upregulated genes were enriched into the RNA-directed DNA polymerase activity，Type Ⅱ site-specific deoxyribonuclease activity and endonuclease activity，and downregulated genes were enriched into pyidoxal binding， peptidase inhibitor activity and RNA-directed DNA polymerase activity. Through KEGG pathway analysis of all DEGs， it was found that 545 DEGs （215 up-regulated genes and 330 down-regulated genes） contained KEGG annotations. Upregulated genes were enriched into the KEGG pathways of protein processing in endoplasmic reticulum， antigen processing and presentation and esterogen signaling pathway，? wherein， downregulated genes were enriched into the KEGG pathways of cytokine-cytokine receptor interaction， cell adhesion molecules and jak-STAT signaling pathway. The expression levels of several genes were selected to validate by real-time PCR and the results showed that they had the similar expression tendency.? [Conclusion] These results could provide reference data for the subsequent analysis of the pathogenesis of A. veronii infection in C. auratus gibelio.

Key words Aeromonas veronii;Carassius auratus gibelio;Expression pattern

鯽魚（異育銀鯽）作為我國重要的淡水養(yǎng)殖魚品種之一，其適應性強、生長速度快、人工養(yǎng)殖簡單及其營養(yǎng)豐富和肉味鮮美，深受消費者的青睞，其養(yǎng)殖量約占全國淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的10.67%[1]。隨著規(guī)?；⒐?jié)約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖魚類因養(yǎng)殖過程中所發(fā)生的因病原體感染造成的經(jīng)濟損失日益加劇。出血性敗血癥對鯽魚養(yǎng)殖的影響非常大，目前認為鯽魚出血性敗血癥由鯉皰疹Ⅱ型病毒（CyHV-2）感染和細菌（維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌）感染引起，其中前者致病性強，致死率高，發(fā)展迅速、短時間內(nèi)可造成大規(guī)模的鯽魚死亡;后者發(fā)病過程相對溫和。關于CyHV-2造成的鯽魚出血性敗血癥已有諸多報道[2-4]，但關于維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）導致的鯽魚出血性敗血癥的報道相對較少，對其發(fā)病機制的了解甚少。

目前，高通量測序技術已發(fā)展成熟，此技術已經(jīng)在大量物種中開展了基因時空表達研究，此技術能夠快速獲得某物種在特定條件下整體基因表達水平的變化，為整體認識物種中基因表達調(diào)控提供了重要的技術手段。RNA-sequencing技術在魚類免疫研究中也得到了廣泛應用，例如研究草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）感染草魚后基因表達差異[5];淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）感染牙鲆（Paralichthys olivaceus）后基因表達差異[6];傳染性鮭魚貧血癥病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）感染大西洋大馬哈魚（Salmo salar）后基因表達差異[7];鯉春病毒血癥病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）感染斑馬魚（Danio rerio）后基因表達差異[8]等;安圭拉弧菌（Vibrio anguillarum）感染大菱鲆（Scophthalmus maximus）后腸道的基因表達差異[9];嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染鈍口鯛（Megalobrama amblycephala）后腎組織的基因表達差異[10];嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染金馬西爾（Tor putitora）后肝臟的基因表達差異[11];愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染黃鯰魚（Pelteobagrus fulvidraco）后脾臟組織的基因表達差異[12]等。此項技術的應用，讓人們從整體水平上認識在病原體感染的情況下宿主細胞內(nèi)基因的表達譜特征變化。

筆者利用RNA-sequencing技術研究了維氏氣單胞菌感染異育銀鯽的腎組織中基因的表達模式，比較分析了維氏氣單胞菌感染和未感染異育銀鯽腎臟組織中基因表達模式的異同，并對差異表達基因進行了功能注釋和信號通路分析，旨在為探索異育銀鯽對維氏氣單胞菌的感染應答機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康異育銀鯽采樣于江蘇省昆山市澄湖水產(chǎn)良種場，體重約30 g/尾，在充氧條件下按照常規(guī)飼養(yǎng)條件進行人工飼養(yǎng)。維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）由筆者所在實驗室保存，來源于自然發(fā)病的異育銀鯽，通過16S rRNA基因測序進行物種鑒定。隨機選取3尾健康異育銀鯽進行腹腔注射，發(fā)病后取其腎臟組織作為試驗組A2;取3尾健康異育銀鯽的腎臟組織作為對照組B。

1.2 試驗方法

1.2.1 文庫構(gòu)建與測序 。

利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit（Ambion-1561）試劑盒提取試驗組和對照組腎臟組織樣本中總RNA;高質(zhì)量的RNA構(gòu)建測序文庫;構(gòu)建的文庫質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢分析;使用Illumina HiSeqTM 4000測序儀進行測序。RNA-sequencing測序委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)評估。

HiSeqTM 4000測序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)raw reads，進行過濾處理獲得clean reads。為了避免樣本污染，隨機從每個樣本中抽取25萬對reads與數(shù)據(jù)庫（ftp：∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）進行比對，分析統(tǒng)計序列來源。

1.2.3 De novo測序。

利用Trinity（trinityrnaseq_r20131110）軟件[13]的paired-end拼接法，將clean reads拼接為轉(zhuǎn)錄本序列;通過序列相似性和長度綜合分析，選取一條最長的轉(zhuǎn)錄本序列作為unigene;運用TGICL2.1軟件[14]聚類去冗余，獲得最終的unigene，de novo拼接所產(chǎn)生的unigene作為后續(xù)分析的參考序列。

1.2.4 基因功能的注釋。

通過Blastx工具將所有獲得的unigene序列分別與數(shù)據(jù)庫NR、SWISSPROT和KOG比對，選取e值<10-5的注釋，獲得與unigene具有序列相似性最高的蛋白;利用KAAS（http：∥www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main）軟件分析unigene所涉及的KEGG信息;根據(jù)SWISSPROT注釋結(jié)果，得到unigene的GO功能注釋信息。

1.2.5

Unigene表達豐度。

使用bowtie2 [15]和eXpress[16] 軟件分析unigene在試驗組和對照組樣本中的表達水平。使用FPKM法（fragments per kilobase per million reads）計算unigene的表達水平[17]。

1.2.6 篩選差異基因（DEGs）。

利用DESeq軟件[18]計算試驗組和對照組樣本中基因表達水平差異，差異基因篩選標準為P<0.05且差異倍數(shù)（fold change）>2。

1.2.7 DEGs的功能注釋（GO）和KEGG富集分析。

利用超幾何分布檢驗方法計算每個GO條目中差異表達基因富集的顯著性。利用KEGG數(shù)據(jù)庫[19]對差異基因進行Pathway分析，并用超幾何分布檢驗的方法計算每個Pathway條目中差異基因富集的顯著性。

1.2.8 Real-time PCR。

為了驗證RNA-sequencing數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選取5個顯著差異表達的mRNA[IL-11（IL）、C型溶菌酶（ctl）、類胰島素生長因子受體（ILG）、白細胞介素-13受體（ILR）、toll樣受體-9（TLR）]進行Real-time PCR驗證。從試驗組和對照組腎臟組織樣本中提取總RNA，DNAse Ⅰ 消化后的總RNA用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR操作按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix說明書進行。Real-time PCR所用定量引物見表1。基因相對表達水平以2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 文庫質(zhì)量檢測與de novo數(shù)據(jù)拼接

通過對試驗組A2和對照組B所構(gòu)建的2個文庫進行RNA-sequencing測序獲得raw bases，經(jīng)過濾后得到clean reads，統(tǒng)計顯示clean reads占raw bases的比例約98%（表2）。隨機從試驗組和對照組樣本中抽取25萬對reads與數(shù)據(jù)庫（nt）比對，分析序列的物種來源。結(jié)果顯示，試驗組A2樣本中reads匹配的前10物種僅為異育銀鯽或其近緣物種，對照組B樣本中reads匹配的前10物種也為異育銀鯽或其近緣物種，及A.veronii（圖1A、B）。以上研究結(jié)果表明，2個樣本測序數(shù)據(jù)具有較高質(zhì)量，且不存在其他微生物污染。為便于后續(xù)的研究和應用，測序的原始數(shù)據(jù)均已保存在NCBI公共數(shù)據(jù)庫SRA（SRR8259812和SRR8259811）。通過對unigene的數(shù)量與長度分布統(tǒng)計，共獲得220 374個unigene，平均長度為818.04 bp（圖1C）。將檢測到的unigene進行數(shù)據(jù)庫物種信息匹配，發(fā)現(xiàn)試驗組注釋的親緣物種top5依次為犀角金線魮（12 722個unigene，占25.83%）、鯉魚（9 915個unigene，占20.13%）、安水金線鲃（8 727個unigene，占17.72%）、金線鲃（5 901個unigene，占11.98%）、斑馬魚（2 878個unigene，占5.84%）（圖1D）。

2.2 unigene功能注釋

為了全面了解所有unigene的潛在功能，將獲得的unigene分別與5個數(shù)據(jù)庫（NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG）進行序列比對，結(jié)果顯示NR數(shù)據(jù)庫中存在49 248個unigene、SWISSPROT數(shù)據(jù)庫含有32 191個unigene、KOG數(shù)據(jù)庫存在24 369個unigene、GO數(shù)據(jù)庫含有28 873個unigene和KEGG數(shù)據(jù)庫含有13 330個unigene（表3）。

將所有unigene進行GO注釋后歸類到生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三大類，并進一步細分至64個亞類中。試驗組樣本中的unigene注釋至BP有164 430個（50.55%），注釋至CC有121 189個（37.26%），注釋至MF有39 670個（12.20%）（圖2A）。將所有unigene進行KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示所有unigene主要分為細胞進程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機系統(tǒng)6個代謝途徑，進一步分析顯示這些unigene參與42個KEGG信號通路。試驗組樣本中發(fā)現(xiàn)13 330個unigene含有KEGG注釋，其中unigene主要富集于信號轉(zhuǎn)導（9 357個unigene）、感染性疾?。? 003個unigene）和癌癥（5 966個unigene）等相關通路（圖2B）。

2.3 差異表達基因統(tǒng)計

根據(jù)差異表達基因（DEGs）篩選要求P<0.05且差異倍數(shù)（fold change）>2，比較了試驗組樣本和對照組樣本中mRNA的表達水平差異，發(fā)現(xiàn)11 567個DEGs，其中5 634個基因表達水平上調(diào)和5 933個基因表達水平下調(diào)。根據(jù)DEGs繪制火山圖（圖3），通過火山圖可以直觀地了解試驗組和對照組樣本中基因的差異表達情況。

2.4 DEGs的GO注釋分析

通過試驗組和對照組樣本中基因表達水平比較以及GO數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)1 325個DEGs存在GO注釋，其中分別包括581上調(diào)表達基因和744個下調(diào)表達基因。GO注釋分析顯示上調(diào)表達基因主要富集于RNA指導的DNA聚合酶活性（RNA-directed DNA polymerase activity）、Ⅱ型特異性脫氧核糖核酸酶活性（Type Ⅱ site-specific deoxyribonuclease acitvity）和內(nèi)切酶活性（endonuclease activity）等（圖4A）;下調(diào)表達基因主要富集于吡哆醛結(jié)合（pyidoxal binding）、肽酶抑制劑活性（peptidase inhibitor activity）和RNA指導的DNA聚合酶活性（RNA-directed DNApolymerase activity）等（圖4B）。

2.5 DEGs的KEGG富集分析

通過試驗組和對照組樣本中基因表達水平比較以及KEGG數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)有545個DEGs參與KEGG信號通路，其中包括215個上調(diào)表達基因和330個下調(diào)表達基因。上調(diào)表達基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、抗原加工和呈現(xiàn)（antigen processing and presentation）和雌激素信號通路（esterogen signaling pathway）等KEGG通路（圖5A）;下調(diào)表達基因主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）和jak-STAT信號通路（jak-STAT signaling pathway）等KEGG通路（圖5B）。

2.6 Real-time PCR驗證

為了驗證RNA-sequencing數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選取5個基因（IL-11、C型溶菌酶、類胰島素生長因子受體、白細胞介素-13受體和toll樣受體-9基因）進行Real-time PCR驗證，結(jié)果顯示Real-time PCR結(jié)果與RNA-sequencing數(shù)據(jù)的變化趨勢相一致（圖6）。

3 討論

鯽魚養(yǎng)殖過程中遭受多種病原菌的感染，維氏氣單胞菌是其中的一種，此類細菌的感染會造成鯽魚出血性敗血癥，嚴重損傷腎臟組織，造成壞死和解體等病理現(xiàn)象。該研究利用維氏氣單胞菌感染異育銀鯽腎臟組織進行比較轉(zhuǎn)錄組分析，以期從基因表達調(diào)控方面明晰異育銀鯽對維氏氣單胞菌感染的免疫應答。由于異育銀鯽的遺傳背景中的基因組信息不清楚，利用de novo測序技術，拼接完成了異育銀鯽的轉(zhuǎn)錄組水平遺傳信息，并在此基礎上開展了維氏氣單胞菌感染和未感染異育銀鯽之間的差異轉(zhuǎn)錄組分析，所獲得的異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組水平的遺傳信息和維氏氣單胞菌感染后的基因表達差異情況，為后續(xù)的解析異育銀鯽對維氏氣單胞菌感染的發(fā)病機制提供參考數(shù)據(jù)。

de novo測序和序列拼接結(jié)果顯示共發(fā)現(xiàn)220 374個unigene，其中57 200條unigene來源于維氏氣單胞菌，163 174條unigene來源于異育銀鯽。通過對163 174條unigene進行GO注釋和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些unigene涉及異育銀鯽的生長發(fā)育、環(huán)境適應及免疫等;KEGG分析結(jié)果也顯示這些unigene參與重要的信號通路（如信號轉(zhuǎn)導、先天免疫和后天免疫信號通路等），說明低等脊椎動物異育銀鯽也具備完整的免疫系統(tǒng)。

嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的且也是危害嚴重的病原體。目前，利用A.hydrophila感染各種魚類研究宿主的免疫應答的研究較多，認識也比較的清晰。Song等[20]利用高通量測序技術比較了A.hydrophila感染和未感染的草魚腸道組織中基因表達差異情況，共檢測到315個上調(diào)表達基因和234個下調(diào)表達基因;在感染A.hydrophila的大黃魚中，利用高通量測序技術共檢測到727個基因表達上調(diào)和489個基因表達下調(diào)[21]。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術檢測溫和氣單胞菌（A.sobria）感染的鯉魚，結(jié)果顯示在感染的肌肉組織中共檢測到7 749個DEGs，其中6 300個上調(diào)表達基因和1 449個下調(diào)表達基因;在脾臟組織中共檢測到7 846個DEGs，其中5 111個上調(diào)表達基因和2 735個下調(diào)表達基因[22]。該研究中轉(zhuǎn)錄組測序維氏氣單胞菌感染的異育銀鯽腎臟組織，共發(fā)現(xiàn)11 567個DEGs，其中5 634個上調(diào)表達基因和5 933個下調(diào)表達基因。這些研究結(jié)果表明不同種類的魚在細菌感染后，其基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生了明顯變化。Li等[23]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析維氏氣單胞菌感染非洲鯰魚（Clarias gariepinus）后不同時間時相脾臟組織基因表達模式情況，共發(fā)現(xiàn)2 482個DEGs，其明顯低于維氏氣單胞菌感染異育銀鯽中的DEGs數(shù)量，也說明不同種類的魚對A.veronii感染的基因表達水平差異及應答反應存在明顯不同。Maekawa等[24]利用不同種類的魚感染不同種類的細菌，研究其基因表達差異，發(fā)現(xiàn)39個DEGS存在于所檢測的加州鱸（Micropterus salmoides）、鯔（Mugil cephalus）、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）和鯉魚（Cyprinus carpio）中;不同魚類中發(fā)現(xiàn)的總DEGs也存在顯著差異，這些研究結(jié)果表明不同種類的魚可能存在特定的免疫應答相關通路。

免疫相關基因irg1l、補體因子D和cfd（NM_001020532.1）在感染中參與應答反應。Hartig等[25]研究斑馬魚感染沙門氏菌1 h后就可檢測到irg1l上調(diào)表達，表明該基因?qū)ι抽T氏菌感染存在一定的迅速應答機制。補體因子D在宿主防御中起重要作用[26]。cfd在牙鲆的各組織中均有表達，感染病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）后牙鲆肝臟、腎臟、脾臟中的cfd均表達上調(diào)升高[26]。該研究中irg1l在維氏氣單胞菌感染腎臟組織后下調(diào)至0.006 8倍;cfd在維氏氣單胞菌感染腎臟組織后上調(diào)9.885 1倍。因此，推測irg1l和cfd在異育銀鯽免疫應答和防御過程中扮演重要角色。

為了能夠了解異育銀鯽對維氏氣單胞菌感染的應答，將篩選出的DEGs進行富集分析。KEGG富集分析顯示維氏氣單胞菌感染后的上調(diào)表達基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、抗原加工和呈現(xiàn)（antigen processing and presentation）和雌激素信號通路（esterogen signaling pathway）等KEGG通路;下調(diào)表達基因富集通路主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）和jak-STAT信號通路（jak-STAT signaling pathway）等KEGG通路，研究結(jié)果表明A.veronii感染異育銀鯽后引起了強烈的免疫應答反應。Rodríguez等[27]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析斑馬魚感染A.hydrophila后皮膚的應答模式，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集于MAPK、p53、Wnt、TGF-β、Notch、ErbB、JAK-STAT、VEGF、mTOR和鈣信號等通路。維氏氣單胞菌感染會的最主要的病理癥狀就是引起異育銀鯽的全身性出血，推測其可能與VEGF信號通路相關。

綜上所述，筆者對異育銀鯽感染維氏氣單胞菌感染后的應答模式進行了分析，比較了異育銀鯽對病原體感染的免疫應答模式，維氏氣單胞菌感染異育銀鯽中發(fā)現(xiàn)多個顯著差異表達基因，這些基因參與了重要的信號通路，尤其是免疫信號通路。這些結(jié)果為探索異育銀鯽對維氏氣單胞菌的感染應答機制提供了線索，為細菌性出血性敗血癥綜合防治奠定了理論基礎。

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基金項目 蘇州大學第六屆“互聯(lián)網(wǎng)+”大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目;蘇州大學第十一屆“蘇大天宮杯”“創(chuàng)青春”大學生創(chuàng)業(yè)項目。

作者簡介 施秀（1999—），女， 江蘇南通人，研究方向：基因表達調(diào)控。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事基因表達與調(diào)控機制研究。

收稿日期 2020-07-09;修回日期 2020-07-24