馮致　楊竣茹　李萌　王惠　楊果　楊婷婷　劉艷玲　王義強

摘要 銀杏酚酸是有多種應(yīng)用前景的活性成分，其生物合成途徑及其調(diào)控機制研究日益增多，逐漸成為研究熱點。概述了銀杏酚酸生物活性，介紹了由脂肪酸合成和聚酮合成共同構(gòu)成的銀杏酚酸合成途徑，總結(jié)了合成中所涉及關(guān)鍵酶（ACP、KAS、SAD、PKSⅢ、PKS-cyclase）的相關(guān)生化與分子生物學(xué)研究進(jìn)展。最后，展望了未來研究的方向。該研究為銀杏酚酸生物合成調(diào)控進(jìn)一步深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞 銀杏酚酸;生物活性;合成途徑;關(guān)鍵酶;聚酮合成

中圖分類號 TQ 914文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）23-0035-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.009

Research Progress of the Biological Activities and Synthesis Pathways of Ginkgo Phenolic Acids

FENG Zhi1，2，YANG Jun-ru2，LI Meng2 et al

（1.Hunan Provincial Key Laboratory for Forestry Biotechnology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha， Hunan 410004; 2. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education， Central South University of Forestry and Technology， Changsha， Hunan 410004）

Abstract Ginkgo phenolic acid is an active component with a variety of application prospects. Its biosynthetic pathways and regulatory mechanisms have been gotten more studies and become a research hotspot. In this research， the bioactive of ginkgo phenolic acid was summarized， the biosynthetic pathway of ginkgo phenolic acid composed of fatty acid synthesis and polyketide synthesis was described， then the biochemical and molecular biology research advances of key enzymes （ACP， KAS， SAD， PKSⅢ and PKS-cyclase） was analyzed and excepted. This research provided references for further study on the regulation of ginkgo phenolic acid biosynthesis.

Key words Ginkgo phenolic acid;Bioactivity;Synthetic pathway;Key enzyme;Polyketide synthesis

銀杏（Ginkgo biloba L.）是現(xiàn)存地球上最古老的樹種，有“金色活化石”的稱號，作為我國特有的經(jīng)濟裸子植物，集食用（白果）、藥用（葉、白果）和觀賞等多種價值于一體。銀杏白果（種仁）是我國著名保健干果，作為一種營養(yǎng)價值高的藥食同源食材，所含白果醇類物質(zhì)（ginnol）是潛在抗“2019-nCoV”病毒的活性成分[1]。銀杏葉片富含黃酮類與內(nèi)酯類物質(zhì)，以丙酮-水為提取劑的銀杏葉提取物（Extraction of Ginkgo biloba，EGB）可進(jìn)一步富集兩種活性物質(zhì)，達(dá)到有效治療心腦血管疾病的目的[2];銀杏以其獨特的葉形、金黃的葉色、挺拔的樹勢成為世界著名的園林綠化觀賞樹種。目前，銀杏已在醫(yī)藥、食品、化妝品、盆景和木材等行業(yè)有深入的開發(fā)，是我國當(dāng)前及未來農(nóng)村經(jīng)濟振興和美麗中國建設(shè)的關(guān)鍵經(jīng)濟樹種之一。自20世紀(jì)70年代以來，我國的銀杏資源快速增長，現(xiàn)有資源占全世界的80%以上，除海南、黑龍江和內(nèi)蒙古3省外，其他各省均有分布（含引種）。當(dāng)前，全國銀杏栽培面積超過33.33萬hm2，年產(chǎn)白果約11 000 t、干青葉約10 000 t，銀杏栽培生產(chǎn)第一產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值約20億元，銀杏加工、制藥（銀杏葉藥）第二產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值達(dá)100億元以上，然而每年因生產(chǎn)廢棄外種皮約30 000 t。張心慧等[3]研究結(jié)果表明，外種皮中含有銀杏酚酸、黃酮、萜內(nèi)酯和多糖等活性物質(zhì)，而Itokawa等[4]研究表明，銀杏酚酸是銀杏中除了銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮之外的另一類重要的活性物質(zhì)，具有殺菌、抑菌、抗炎、抗病毒及驅(qū)蟲、殺蟲作用，極具開發(fā)價值。因此，大量廢棄的外種皮在污染環(huán)境的同時也造成資源的浪費。

20世紀(jì)70年代，Gellerman等[5-7]從銀杏葉、未成熟種仁和成熟外種皮檢測到酚脂類物質(zhì)—銀杏酚酸，隨后的定量測定顯示，銀杏酚酸富集于成熟的外種皮中;王杰等[8]和李洪慶等[9]利用質(zhì)譜檢測技術(shù)從銀杏酸性提取物中鑒定出4種銀杏酸和2種銀杏酚;現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，銀杏酚酸具有一定的致敏性毒性和細(xì)胞毒性，可抗細(xì)菌和真菌增長，具有殺滅害蟲的功效。已有大田栽培實驗證明，銀杏酚酸可作為生物源農(nóng)藥進(jìn)行開發(fā)，未來或能在醫(yī)藥和化妝品等多領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。但相較于銀杏黃酮和萜內(nèi)酯等藥理活性明確的物質(zhì)，銀杏酚酸的生物合成途徑、調(diào)控機制和衍生物功效等未得到深入研究，使得抑制銀杏酚酸合成的分子生物學(xué)技術(shù)和發(fā)酵高產(chǎn)銀杏酚酸的工程應(yīng)用研發(fā)緩慢，從而阻礙銀杏產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步開拓。

鑒于此，筆者概述了近年來銀杏酚酸生物活性研究基礎(chǔ)，詳述了由脂肪酸合成和聚酮合成共同構(gòu)成的銀杏酚酸合成途徑，總結(jié)了合成中所涉及關(guān)鍵酶的催化機制，展望了未來研究的方向，旨在為銀杏酚酸的后續(xù)研究提供參考和理論支撐。

1 銀杏酚酸生物活性

銀杏酚酸屬于酚脂家族的一員，該家族中有4大類，包括烷基酚（alkyphenols）、烷基間苯二酚（alkylresorcinols）、漆酸（anacardic acids）和烷基兒茶酚（alkylcatechols）[10]。它們是植物中一類次生代謝產(chǎn)物，不同種類的植物可能含獨有的酚脂類物質(zhì)，主要生理功能是抗生物或非生物類協(xié)迫。

1.1 銀杏酚酸組成與理化性質(zhì)

銀杏酚酸為銀杏重要次生代謝產(chǎn)物，屬漆酚酸類物質(zhì)，包括銀杏酸（ginkgolic acid）、銀杏酚（ginkgol）和銀杏二酚（bilobol）3類成分[11]。銀杏酸是側(cè)鏈長度為13、15、17且側(cè)鏈雙鍵數(shù)為0～2的2-羥基-6-烷（烯）基-苯甲酸（圖1 a），目前共分離鑒定5種，分別是白果新酸、白果酸、氫化白果酸、十七烷一烯基銀杏酸和十七烷二烯基銀杏酸。銀杏酚是側(cè)鏈長度為15、17，側(cè)鏈雙鍵數(shù)為1的3-烷（烯）基苯酚，共2種;銀杏二酚是側(cè)鏈長度為15、17，側(cè)鏈雙鍵數(shù)為2的5-烷（烯）基間苯二酚（圖1 b），共 2種。牻牛兒苗家族（Geraniaceae family）的天竺葵（Pelargonium hortorum）[12]、漆科家族（Anacardiaceae family）的槚如樹（Anacardium occidentale）[13]等植物也含有漆酚酸類物質(zhì)，其烷基/烯基側(cè)鏈長度、不飽和鍵數(shù)目有區(qū)別，但化學(xué)結(jié)構(gòu)與銀杏酚酸相似。銀杏酸是銀杏酚酸的主要物質(zhì)，占整個酸性提取物的90%。5種銀杏酸所占比例不同，主要是白果酸（含量50%），其次是十七烷一烯基銀杏酸（22%）和白果新酸（20%）[14]（圖2）。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在銀杏葉、外種皮和種仁中均檢測出銀杏酸，不同品種（株系）的銀杏葉總銀杏酸含量約為14.576 5～23.681 3 mg/g[15]，成熟的種仁總銀杏酸含量約為0.11 mg/g[14]，外種皮中總銀杏酸含量可達(dá)到28.78 mg/g[16]。

銀杏酚酸的熔點在41～42 ℃，常溫下純品呈現(xiàn)油狀或者粉末狀，難溶于水或乙醇等極性溶劑，易溶于輕質(zhì)石油醚等非極性溶劑，且在飽和的石油醚溶劑中會以晶體的形式析出[17]。在溶液中，酚酸苯環(huán)上的羥基和羧基電離產(chǎn)生弱酸性，可發(fā)生酯化和皂化反應(yīng)，經(jīng)酯化或皂化的銀杏酚酸更易于萃取、分離，達(dá)到提純的效果。銀杏酚酸的熔點約為136 ℃、沸點約為500 ℃，在200 ℃時酚酸苯環(huán)上的羧基會發(fā)生脫羧反應(yīng)釋放CO2，利用溫度梯度法可以對其進(jìn)行分離。因此，根據(jù)理化性質(zhì)研究，在銀杏產(chǎn)品加工中常采用“熱風(fēng)蒸煮處理”“銀杏酚酸超聲波輔助提取樹脂吸附”“中藥配伍”等方法進(jìn)行脫酚酸處理以達(dá)到脫毒目的。Chen等[18]最新研究結(jié)果表明，將漆酶固定化在新型電紡納米纖維氈上可催化降解銀杏酚酸。但是上述脫酚酸方法存在成本高昂、操作難度大等缺點，不易作為大規(guī)模脫毒使用。

1.2 銀杏酚酸的生物學(xué)活性

銀杏酚酸有抗菌、抗蟲、致敏、細(xì)胞毒性和抗癌等作用，利用其多樣的生物學(xué)活性，可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用。

1.2.1 抗菌作用。

銀杏酸是6-烷基水楊酸，有廣泛抗菌性，對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌以及多種革蘭氏陰性和陽性菌均有抑制作用[19-20]。其酸性提取劑對水稻紋枯病菌、番茄青枯病菌、蘋果炭疽菌、玉米大斑菌和赤霉菌均有抑制作用，抗菌效果與一些抗真菌類藥物相當(dāng)[21]。徐立春等[22]研究結(jié)果表明，0.1%的白果酸（15∶1）抑制真菌的有效率為92%，而0.5%克霉唑抑制真菌有效率僅為68%。Muroi等[23]研究表明，銀杏酸與標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物在殺滅抗甲氧西林金黃色葡萄球菌時有協(xié)同作用，在48 h內(nèi)同時使用的菌體殺滅活性比單一藥物殺滅效果至少高100倍。

1.2.2 抗蟲作用。

現(xiàn)已證明銀杏酚酸對蚜蟲、蠐螬、菜青蟲、紅蜘蛛、桑蟥、稻螟及其他咀嚼口器昆蟲有明顯的殺滅作用[20]。石啟田[24]在防治蚜蟲試驗中發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸提取物的殺滅效果與農(nóng)藥吡蟲啉相當(dāng)。鄧業(yè)成等[25]利用不同極性的外種皮提取液進(jìn)行觸殺試驗，發(fā)現(xiàn)其對褐飛虱子、桃蚜、紅蜘蛛和菜粉蝶幼蟲有較強殺滅作用。

1.2.3 致敏作用。

1934年Hill等[26]報道了銀杏中某種活性物質(zhì)會對皮膚產(chǎn)生強烈的糜爛作用，1969年Gellermen分別從腰果和銀杏種實中分離得到漆酚酸類物質(zhì)，并指出其對皮膚有強烈致敏作用[5]。成亮等[27]報道顯示，白果酸（C15∶1）通過代謝作用轉(zhuǎn)化成銀杏酚，經(jīng)進(jìn)一步氧化反應(yīng)形成鄰苯二酚引起過敏反應(yīng)。Vincieri等[28]研究顯示，銀杏酚酸可以抑制糖代謝中的多種脫氫酶活性。Ahlemeyer等[29]發(fā)現(xiàn)銀杏酸對甘油-3-磷酸脫氫酶有競爭性抑制作用。有關(guān)學(xué)者推測銀杏酚酸具有雙極性（親水性和親脂性），可以抑制機體或器官相關(guān)酶活性，進(jìn)而影響代謝導(dǎo)致過敏[30]。

1.2.4 細(xì)胞毒性。

銀杏酚酸具有親水和親脂基團，能跨膜結(jié)合在細(xì)胞膜上，造成細(xì)胞死亡。Al-Yahya等[31]用含有銀杏酸的銀杏提取物對雄性大鼠進(jìn)行毒性試驗，結(jié)果表明提取物能造成生殖細(xì)胞等染色體丟失，影響大鼠的正常生殖功能。Ahlemeyer等[29]發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致小雞晶胚神經(jīng)細(xì)胞的死亡。近幾年研究人員對多種銀杏酸的毒性分別進(jìn)行研究，Jiang等[32]發(fā)現(xiàn)白果酸（C15∶1）能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)并造成嘌呤代謝紊亂誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞損傷。Yao等[33]發(fā)現(xiàn)十七烷一烯基銀杏酸（C17∶1）對HepG2細(xì)胞的毒性與時間和劑量呈正比，通過介導(dǎo)CYP1A和CYP3A代謝作用增強細(xì)胞毒性。研究表明，在銀杏酚酸中，白果新酸（C13∶0）、白果酸（C15∶1）和十七烷一烯基銀杏酸（C17∶1）毒性較強，其他酚酸類物質(zhì)能與3種銀杏酸共同作用增加細(xì)胞毒性。

1.2.5 抗癌作用。

銀杏酚酸具有細(xì)胞毒性，能起到抗癌作用。 Qiao等[34]發(fā)現(xiàn)銀杏酸能誘導(dǎo)磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）的激活來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移。Liang等[35]發(fā)現(xiàn)銀杏酸能抑制ROS調(diào)控的STAT3/JAK2信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增長。Liu等[36]研究結(jié)果表明銀杏酸會阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞分裂G0/G1期的過渡，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，而體外細(xì)胞試驗表明，銀杏酸能抑制癌癥細(xì)胞的增殖、遷移并激活相關(guān)酶促使細(xì)胞凋亡，未來或成為一種輔助抗癌藥物用于腫瘤治療。

2 銀杏酚酸生物合成

20世紀(jì)70年代，美國Minnnesota University的Gellerman利用14C標(biāo)記法對銀杏酚酸合成途徑進(jìn)行了初步探索。20世紀(jì)90年代，Walters等[37]利用氣液色譜法（GLC trappmg）對從液相色譜（HPLC）提取的標(biāo)記單甲基脂酰類物質(zhì)進(jìn)行分析，確定了天竺葵中漆酸（2-羥基-6-烷（烯）基-苯甲酸）的具體合成步驟。Singhal[38]和Narnoliya等[39]進(jìn)一步探究了漆酸合成關(guān)鍵酶的種類和功能。

2.1 銀杏酚酸生物合成途徑

Gellerman等[6-7]認(rèn)為銀杏酸的芳香環(huán)和長鏈烷基/烯基是分步合成的，根據(jù)試驗推論分為3部分：①丙二酰-CoA與乙酰-CoA經(jīng)脂肪酸合成反應(yīng)形成游離的棕櫚油酰-CoA和油酰-CoA;②長鏈?；鵆oA經(jīng)聚酮合成形成銀杏酸;③銀杏酸脫去苯環(huán)的羧基，氧化還原成銀杏酚等物質(zhì)。

天竺葵（Pelargonium hortorum）是牻牛兒苗科植物，它的毛狀體僅會分泌漆酸（銀杏酸同系物），是現(xiàn)有研究漆酸合成途徑的最佳物種。野生型天竺葵分泌側(cè)鏈烷基飽和的漆酸，而抗蟲型分泌側(cè)鏈單不飽和漆酸（C15∶1和C17∶1）。研究發(fā)現(xiàn)天竺葵的單不飽和漆酸與2種銀杏酸（白果酸（C15∶1）和十七一烯基銀杏酸（C17∶1））除雙鍵位置有差別外，分子結(jié)構(gòu)完全相同。Hesk等[12]對野生型和抗蟲型天竺葵差異基因及代謝物進(jìn)行比較，初步揭示了漆酸合成的分子機制。研究人員利用RNA-seq技術(shù)構(gòu)建天竺葵cDNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過基因注釋比對和差異性表達(dá)分析，鑒定合成關(guān)鍵基因是Ⅲ型聚酮合成酶（Polyketide Synthases Ⅲ，PKS Ⅲ）基因和硬脂酰-ACP脫氫酶（Stearotyl-ACP Desaturase，SAD）基因。以白果酸（15∶1）和十七烷一烯基銀杏酸（17∶1）為例，闡釋銀杏酚酸的合成調(diào)控途徑：

2.1.1 烷基側(cè)鏈的合成。

漆酚酸的合成首先基于棕櫚油酸和油酸的合成，即烷基側(cè)鏈的合成（圖3）。儲存的蔗糖糖酵解成磷酸烯醇式丙酮酸，在丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）變構(gòu)作用下形成丙酮酸由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入質(zhì)體，再由丙酮酸脫氫酶（Pyruvate Dehydrogenase，PDH）催化生成乙酰-CoA，為脂肪酸提供起始2C分子。乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase，ACC）催化下形成丙二酰-CoA。轉(zhuǎn)?；福═ransacylase，TA）將CoA分子替換為?；d體蛋白（Acyl Carrier Protein，ACP）形成丙二酰-ACP。丙二酰-ACP脫去羧基得到乙酰-ACP，并在酮酯酰合成酶Ⅲ（β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅲ，KASⅢ）作用下縮合循環(huán)形成初始物4C?；?ACP。4C?；?ACP經(jīng)酮酯酰合成酶Ⅰ（β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅰ，KASⅠ）多次縮合催化形成棕櫚酰-ACP（C16∶0 ACP），并由Δ9-硬脂酰-ACP去飽和酶（Δ9-Stearoyl-ACP Desaturase，SAD）脫氫成棕櫚油酸-ACP（Δ9 C16∶1 ACP），再經(jīng)酮酯酰合成酶Ⅱ（β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅱ，KASⅡ）催化生成油酰-ACP（Δ11 C18∶1 ACP）。質(zhì)體中的棕櫚油酰-ACP和油酰-ACP分別在硫酯酶A（Thioesterase，TE/FatA）和硫酯酶B（Thioesterase，TE/FatB）作用下脫去?；d體蛋白（ACP），形成游離的不飽和脂肪酸[40]。最后，游離脂肪酸在質(zhì)體外膜的酮酯酰-CoA合成酶（Acyl-CoA Synthase，ACS）作用下形成棕櫚油酰-CoA（Δ9 C16∶1CoA）和油酰-CoA（Δ11 C18∶1 CoA）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，成為2種銀杏酸的重要前體物質(zhì)。

然而銀杏酚酸和天竺葵中漆酚酸的脂肪酸合成途徑有差別，白果酸（C15∶1）和十七烷一烯基銀杏酸（C17∶1）的合成前體是棕櫚油酸（Δ9 C16∶1）和油酸（Δ11 C18∶1），而2種單烯側(cè)鏈漆酸的合成前體是棕櫚油酸（Δ11 C16∶1）和油酸（Δ13 C18∶1）。而常見的ω-7脂肪酸（棕櫚油酸（Δ9 C16∶1）和油酸（Δ11 C18∶1））能在許多野生植物和藻類中以棕櫚酰-ACP（C16∶0 ACP）為前體經(jīng)去飽和、聚酮等反應(yīng)形成。Schultz等[41]研究發(fā)現(xiàn)，天竺葵中1種新型脂酰ACP去飽和酶對肉豆蔻酰-ACP（C14∶0 ACP）進(jìn)行脫氫形成十四碳一烯酰-ACP（Δ9 C14∶1），再經(jīng)聚酮等反應(yīng)下形成2種單不飽和脂肪酸（棕櫚油酸（Δ11 C16∶1）和油酸（Δ13 C18∶1））。因此，銀杏酸前體脂肪酸的合成途徑相較于天竺葵的漆酸更易探究。

Singhal[38]對天竺葵中單不飽和脂肪酸（棕櫚油酸和油酸）合成的相關(guān)基因進(jìn)行鑒定和表達(dá)驗證，結(jié)果表明當(dāng)組織中酰基載體蛋白（Acyl carrier proteins，ACPs）、酮酯酰合成酶（KASs）和硫酯酶（TEs）的基因表達(dá)量較高時，脂肪酸含量及漆酸含量較高。?；d體蛋白（ACP）作為中間保守載體，是脂肪酸合成過程的中心，它與?；?ACP去飽和酶（Acyl-ACP Desaturase，AAD）共同作用使?；溔ワ柡?，改變飽和和非飽和脂肪酸含量比例，也能與酮酯酰-ACP合成酶（KAS）一同作為限速酶調(diào)控酚酸的合成速率。

2.1.2 酚脂苯環(huán)合成。

酚脂苯環(huán)合成是以高級脂肪酸為前體形成酚酸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其合成途徑見圖4。以白果酸（C15∶1）為例，首先經(jīng)脂肪酸途徑的棕櫚油酰（Δ9 C16∶1）以丙二酰-CoA為底物，在Ⅲ型聚酮合成酶（Polyketide Synthase Ⅲ，PKSⅢ）的作用下，通過2次縮合反應(yīng)，在?；嗽黾?個碳原子;其次，C3位的酮基在酮基還原酶（PKS-ketoacyl-CoA reductase，KR）的作用下形成羥基并由脫水酶（PKS-dehydratase，DH）脫去一分子水形成雙鍵;第三，經(jīng)縮合聚合再在酰基端增加2個碳原子，此時，C2位的氫離子會與C7位的酮基靠近來保持4，15-二烯三肽中間體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定;第四，在保證C1位的酮基不會脫羧情況下，環(huán)化酶（PKS-Cyclase）催化C2位的氫離子與C7位的酮基發(fā)生類似于醇醛縮合（Aldol condesation）環(huán)化，并在脫水酶（PKS-dehydratase）的作用下成雙鍵;第五，烯基還原酶（PKS-enoyl reductase，ER）催化六圓碳環(huán)上的酮基形成雙鍵并芳構(gòu)化，它與C1羧基共同組成苯甲酸結(jié)構(gòu);最終形成單不飽和側(cè)鏈的白果酸（C15∶1）[37，39]。

植物Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）是酚脂類物質(zhì)（烷基酚、烷基間苯二酚、漆酸和烷基兒茶酚等）的限速酶[42]。查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）和芪合酶（Stilbene synthase，STS）是其中最具代表的2個超家族，它們分別能夠催化?；湹腃1和C6位縮合環(huán)化（克來森縮合，Claisen condensation）和C2和C7位縮合環(huán)化（醇醛縮合，Aldol condensation），形成酚類物質(zhì)。但是漆酸類物質(zhì)能催化C2位的氫離子與C7位的酮基縮合的同時保留C1位的羧基形成苯甲酸，這種保留了苯環(huán)羧基的聚酮環(huán)化反應(yīng)在植物中較為少見。因此，Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）、環(huán)化酶（PKS-Cyclase）和酮基還原酶（PKS-ketoacyl-COA reductase，KR）等深入研究能進(jìn)一步揭示銀杏酸的合成機制，結(jié)合理化或生物技術(shù)手段控制銀杏組織中酚酸的含量。

2.2 酚酸合成關(guān)鍵酶基因

目前，酚酸合成關(guān)鍵酶基因研究的主要報道來源于漆酚酸，而銀杏酚酸鮮有報道。酚酸合成途徑分為2部分：脂肪酸合成與芳香環(huán)合成。其中?；d體蛋白（ACP）、硬脂酰去飽和酶（SAD）、酮酯酰-ACP合成酶（KASs）、Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）、環(huán)化酶（PKS-Cyclase）是關(guān)鍵酶，決定漆酸類物質(zhì)合成速率及含量比例。

2.2.1 ?；d體蛋白（ACP）。

?；d體蛋白（ACP）屬于載體蛋白大家族，作為一類混合蛋白能夠關(guān)聯(lián)各種蛋白復(fù)合酶體系，將?；湉囊粋€酶中心位點轉(zhuǎn)移到另一個酶中心位點。它還是硬脂酰-ACP去飽和酶（SAD）、脂酰基-ACP脫氫酶（Acyl-ACP hydrolase，AAH）的輔助因子，在脂肪酸合成（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）和聚酮合成（PKS）途徑中起重要作用。

李孟軍等[43]對擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Clycine max）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）等17個物種的?；d體蛋白基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并劃分為5類。其中，質(zhì)粒型ACP基因家族（編碼區(qū)由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成）和線粒體型ACP基因家族（編碼區(qū)由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成）占整體比例最大，它們都有1個非常保守的絲氨酸位點能與4-磷酸泛酰巰基乙胺輔基組結(jié)合，并激活holo-ACP發(fā)揮作用。ACP蛋白家族三級結(jié)構(gòu)大多是一致的，由4個保守α螺旋組成，其中3個α螺旋（Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ）相互平行，而α螺旋（Ⅲ）垂直于螺旋中心，形成1個疏水結(jié)構(gòu)腔，為各種?；溙峁┍幼o(hù)[44]。α螺旋Ⅱ能與酮酯酰合成酶Ⅱ（β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅱ，KAS Ⅱ）相互作用進(jìn)一步延長酰基鏈，被稱為識別螺旋。Singhal[38]對天竺葵進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序，篩選出漆酚酸合成有關(guān)的2個完整ACP蛋白cDNA序列（Pxh1和Pxh2），通過基因表達(dá)驗證和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Pxh1和Pxh2基因在天竺葵毛狀體組織有較高的表達(dá)，并且與芫荽（Coriandrum sativum）的十四碳一烯酸（Δ9 C14∶1）生物合成ACP蛋白基因高度同源，能催化漆酸途徑中脂肪酸的去飽和。

2.2.2 酮酯酰-ACP合成酶（KASs）。

在脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）復(fù)合體的作用下，以丙二酰-ACP為底物經(jīng)多次縮合循環(huán)形成銀杏酸前體棕櫚油酸（Δ9 C16∶1）和油酸（Δ11 C18∶1）。脂肪酸合成酶復(fù)合體由3種酮酯酰-ACP合成酶（KASs）所構(gòu)成，屬于cond-enzymes超家族蛋白，它們都是含有KAS保守結(jié)構(gòu)域、無信號肽的疏水性脂溶蛋白。KASⅢ催化丙二酰-CoA和乙酰-CoA聚合成起始?；湥?-酮丁酰-ACP）;KAS Ⅰ催化?；溑c丙二酰-ACP的聚合，形成6C-16C的脂肪酸;KAS Ⅱ催化丙二酰-ACP與棕櫚酸縮合，生成18C脂肪酸。在紫蘇[45]和陸地棉[46]等植物中KASⅡ是氨基酸長度約為500 aa、略偏酸性的非分泌蛋白，它決定C16∶C18脂肪酸的比值，能調(diào)控植物抗寒性。研究人員從天竺葵轉(zhuǎn)錄組中得到7個酮酯酰-ACP合成酶（KASs）基因，其中PxKASⅠa、PxKASⅠb和PxKASⅠc在天竺葵的毛狀體組織中有高且穩(wěn)定的表達(dá)，而在其他組織中基因表達(dá)量較低。進(jìn)一步對毛狀體進(jìn)行溫度梯度（18、23和28 ℃）處理，結(jié)果顯示3個基因的表達(dá)量隨溫度的升高而降低，與脂肪酸（棕櫚油酸（Δ11 C16∶1）和油酸（Δ13 C18∶1））及漆酸含量呈正相關(guān)，或參與漆酸合成途徑。進(jìn)化分析表明，天竺葵的KAS基因家族與擬南芥（Arabidopsis thailana）和大豆（Glycine Max）的酮酯酰合成酶基因（KAS）高度同源，相關(guān)催化機制較明晰。然而，銀杏酮酯酰-ACP合成酶（KAS）的分子研究甚少，白果酸（C15∶1）和十七烷一烯基銀杏酸（C17∶1）的前體棕櫚油酸（Δ9 C16∶1）和油酸（Δ11 C18∶1）作為重要的單烯不飽和脂肪酸是如何受到銀杏的酮酯酰-ACP合成酶家族的調(diào)控，有待深入探究。

2.2.3 硬脂酰-ACP去飽和酶（SAD）。

硬脂酰-ACP去飽和酶（SAD）是植物中唯一已知的可溶性去飽和酶家族，它能調(diào)控飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例。其中，Δ9 硬脂酰-ACP去飽和酶在植物中的研究最廣泛，它能催化?；淐9位與C10位脫氫形成第1個雙鍵。SAD蛋白是一個同源二聚體，由屬于?；?ACP去飽和酶家族和屬于鐵蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域組成。位于SAD保守區(qū)的4個α螺旋形成1個四螺旋束結(jié)構(gòu)，埋藏著1個對稱的Fe-O-Fe二鐵簇催化中心，它們共同構(gòu)成酶活中心用于?；溍摎鋄47]。蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示，SAD酶有1個從分子表面延伸至內(nèi)部的深槽，可以容納18C的酰基鏈與槽底部的二鐵中心結(jié)合，發(fā)生氧化還原反應(yīng)。這樣1個槽體結(jié)構(gòu)也能容納16C和14C的?；湴l(fā)生反應(yīng)，但催化運轉(zhuǎn)速率較低[48]。

Schultz等[41]在天竺葵cDNA文庫中篩選出一個新型?；?ACP去飽和酶，通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)與蓖麻子（Castor bean）硬脂酰-ACP去飽和酶基因（SAD）高度同源，利用大腸桿菌（E.coli）遺傳轉(zhuǎn)化驗證結(jié)果顯示，新型基因可催化肉豆蔻酰-ACP（C14∶0）脫氫形成十四碳一烯酰-ACP（Δ9 C14∶1），因此將其命名為肉豆蔻酰-ACP去飽和酶基因（MAD，Δ9 14∶0-ACP? desaturase）。Singhal[38]基因表達(dá)檢測和煙草（Nicotiana tabacum）遺傳轉(zhuǎn)化驗證結(jié)果顯示，肉豆蔻酰-ACP去飽和酶（MAD）所催化的產(chǎn)物——十四碳一烯酰-ACP（Δ9 C14∶1）是棕櫚油酰-ACP（Δ11 C16∶1）和油酰-ACP（Δ13 C18∶1）的關(guān)鍵前體。通過對酶活性、脂肪酸含量和酚酸含量檢測發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻酰-ACP去飽和酶（MAD，Δ9 14∶0-ACP? desaturase）的活性決定了棕櫚油酰-ACP（Δ11 C16∶1）和油酰-ACP（Δ13 C18∶1）的含量，進(jìn)而調(diào)控2種單烯側(cè)鏈漆酸（C22∶1和C24∶1）的含量。另外，Singhal[38]設(shè)置溫度梯度（18、23和28 ℃）探究天竺葵毛狀體組織中相關(guān)酶基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酰-ACP去飽和酶基因（MAD，Δ9 14∶0-ACP? desaturase）和硬脂酰-ACP去飽和酶基因（SAD，Δ9 18∶0-ACP desaturase）的表達(dá)量隨著溫度的升高而降低。

Wang等[49]從銀杏葉片cDNA文庫克隆了1個硬脂酰-ACP去飽和酶基因（SAD，Δ9 18∶0-ACP desaturase）并對銀杏葉片進(jìn)行溫度脅迫處理（4、15和45 ℃），結(jié)果顯示在低溫（4 ℃）和常溫（15 ℃）作用下基因的表達(dá)量高，而在高溫（45 ℃）作用下基因表達(dá)量要比對照組低數(shù)倍。隨后，劉新亮等[50]分析表明，GbSAD基因能編碼一段鏈長412 aa、分子量47 kDa的肽鏈，聚類分析顯示與其他裸子植物的硬脂酰-ACP去飽和酶（SAD）氨基酸序列相似度較高。外源噴施激素實驗表明，GbSAD基因的表達(dá)不受脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯（ETH）的調(diào)控，但水楊酸（SA）會激活基因的表達(dá)，其表達(dá)量最高值是對照組的9.7倍，說明SA可能參與脂肪酸合成途徑的調(diào)控。

天竺葵中特有的肉豆蔻酰-ACP去飽和酶（MAD，Δ9 14∶0-ACP? desaturase）和銀杏的硬脂酰-ACP去飽和酶（GbSAD，Δ9 18∶0-ACP desaturase）的都對溫度敏感且在低溫下活性高，2種酶都屬于植物唯一的水溶性去飽和酶，在功能結(jié)構(gòu)上相似度較高。因此，對于銀杏硬脂酰-ACP去飽和酶（GbSAD，Δ9 18∶0-ACP desaturase）進(jìn)行同源性功能驗證，將會進(jìn)一步明晰銀杏酚酸的合成機制。

2.2.4 Ⅲ型聚酮合酶（PKSⅢ）。

聚酮合成酶分為3類：①PKSⅠ，稱為模塊PKS，由若干個多功能多肽組成，每1個多肽都分別攜帶有獨特的、非重復(fù)使用催化結(jié)構(gòu)域。②PKS Ⅱ，稱為迭代或者芳香式PKS，它是1個多酶復(fù)合體的迭代體系，通過一套可重復(fù)使用的結(jié)構(gòu)域在重復(fù)的反應(yīng)步驟中多次用來催化酚聚酮結(jié)構(gòu)的生成。③PKSⅢ，稱為查爾酮合成型酶，與前2類PKS酶家族完全不同，它能重復(fù)使用同源雙基蛋白，不依賴ACP及其活性位點4-磷酸泛酰基巰基乙胺的激活，也無需通過ACP活化酰基-CoA底物，能直接與酰基-CoA進(jìn)行反應(yīng)。盡管不同類型PKS結(jié)構(gòu)機制不同，但它們都是利用酮基合成酶（Ketosynthase，KS）結(jié)構(gòu)域或亞基催化C-C鍵的形成，使?；?CoA脫羧縮合延長碳鏈。

PKSⅢ家族種類繁多，查爾酮合成酶（Chalcone Synthsae，CHS）和芪合酶（STS）是最早被發(fā)現(xiàn)且最具代表性的2個家族，它們的氨基酸序列相似度為60%～75%[42]。查爾酮合成酶（CHS）家族廣泛存在于植物中，是分子量為40～45 kDa的蛋白同源二聚體，利用高度保守的活性中心（Cys-His-Asn的組合結(jié)構(gòu)）以3個丙二酰-CoA為底物催化香豆蔻CoA的碳鏈延長，形成四肽中間環(huán)結(jié)構(gòu)[42，51-52]。四肽中間環(huán)的C6氫離子與C1酮基會發(fā)生克萊森縮合反應(yīng)（Claisen condensation）形成碳六元環(huán)，然后芳構(gòu)化成二苯基丙烯酮，又稱為查爾酮（圖5）。查爾酮是黃酮類物質(zhì)合成的重要前體。芪合酶（STS）在植物和微生物（如鏈霉菌屬、酵母和細(xì)菌）中有報道，分子量約為43 kDa，由2個亞基組成的二聚體，擁有特異性保守結(jié)構(gòu)域IPNS（F）AGAIAGN的蛋白，與查爾酮合成酶（CHS）高度同源[53]。STS酶以香豆酰CoA為底物形成四肽中間環(huán)結(jié)構(gòu)，四肽中間環(huán)的C7酮基與C2氫離子會發(fā)生醇醛縮合縮合反應(yīng)（Aldol condensation）形成碳六元環(huán)，然后芳構(gòu)化形成植保素白藜蘆醇苷[54]（圖5）。Singhal[38]在天竺葵（Pelargonium hortorum）中鑒定出1種2型酮?；鵆oA合成酶（KCS2，Keto-acyl CoA synthase 2），它的三級空間結(jié)構(gòu)與Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）相似，推測其參與漆酸合成途徑中環(huán)化縮合反應(yīng)。酮?；鵆oA合成酶（KCS）作為超長鏈脂肪酸（Very long chain fatty acids，VLCFAs）合成過程中催化第一步縮合反應(yīng)的限速酶，其基因家族研究主要集中在模式植物擬南芥上，而少有在其他植物中的研究報道。Costaglioli等[55]根據(jù)基因同源性和遺傳進(jìn)化分析，將擬南芥中21個KCS基因成員分為4個亞組（FAE1、KCS1、FDH和CER6）。其中FAE1基因是由James等[56]最早利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法所克隆得到的KCS家族基因，F(xiàn)AE1的氨基酸序列與其他的聚酮縮合酶（查爾酮合成酶（CHS）、芪合酶（STS）和Ⅲ型酮酯酰-ACP合成酶（KASⅢ））具有高度的同源性。

不同物種的酮酯酰CoA合成酶（KCS）具有不同的底物特異性。銀杏酚酸屬漆酚酸類物質(zhì)，其途徑中特有的Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）在功能結(jié)構(gòu)上或與天竺葵的2型酮酰基CoA合成酶（Keto-acyl CoA synthase 2）相類似。此外，漆酚酸途徑的聚酮合成酶與芪化酶（STS）都會識別四肽中間環(huán)的C7酮基與C2氫離子發(fā)生醇醛縮合反應(yīng)形成碳六元環(huán)，不同的是芪化酶（STS）在醇醛縮合環(huán)化反應(yīng)中會發(fā)生脫羧反應(yīng)，使C1位的酮基氧化釋放二氧化碳，而漆酚酸的聚酮環(huán)化過程中卻保留了C1位酮基，并由氫離子（H+）取代CoA形成苯甲酸結(jié)構(gòu)。目前該催化機制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.2.5 聚酮環(huán)化酶（PKS-cyclase）。

2，4-二羥基-6-戊基苯甲酸（Olivetolic acid）又稱作橄欖醇酸，是合成大麻素的重要前體。Gagne等[57]發(fā)現(xiàn)己酰-CoA在大麻的PKSⅢ（TKS）的催化下合成含有12個碳的四肽中間環(huán)結(jié)構(gòu)。若TKS酶繼續(xù)催化，?；淐2位與C7位縮合環(huán)化并釋放CO2，得到3，5-二羥基戊苯（Olivetol）;而由PKS環(huán)化酶（Olivetolic acid cyclase，OAC）所催化縮合環(huán)化反應(yīng)會保留C1位羧基，得到2，4-二羥基-6-戊基苯甲酸（Olivetolic acid）。蛋白功能分析表明，OAC酶含有特有的β-α-β-β-α-α-β拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能催化?；鵆2位和C7位環(huán)化縮合并保留羧基。OAC是一種含有二聚α+β桶狀結(jié)構(gòu)域（Dimeric α+β barrel protein，DABB）的新功能蛋白，這種蛋白主要存在于細(xì)菌、真菌和植物中。除了大麻的橄欖醇酸環(huán)化酶CsOAC 外，植物DABB 類蛋白主要來自熱穩(wěn)定性蛋白家族（heat stable protein，HS），它們與鏈霉菌屬（Streptomyces species）的聚酮環(huán)化酶在結(jié)構(gòu)上非常相似[58]。DABB蛋白是一種小蛋白（12 kDa，101 aa），它與PKSⅢ均定位于細(xì)胞質(zhì)，通過引導(dǎo)四肽中間產(chǎn)物的折疊起到伴侶作用（Chaperone like role），最終形成含有苯甲酸結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。Gagne等[51]的研究為漆酚酸合成的聚酮環(huán)化保留了C1位酮基，形成苯甲酸催化過程提供新的參考和思路。

3 展望

20世紀(jì)60年代，銀杏酚酸被鑒定為銀杏外種皮的活性物質(zhì)之一，隨著高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)的普及和NMR（核磁共振技術(shù)）檢測精度的提高，現(xiàn)已能從銀杏葉和果等組織中分離鑒定出常見的5種銀杏酸和4種銀杏酚。銀杏酚酸屬漆酚酸類物質(zhì)，特有的兩極性（疏水性和親水性）使其在醫(yī)療、化工、美容和病蟲害防治等多項領(lǐng)域已得到應(yīng)用。其中，白果酸（C15∶1）更是被Fukuda等[59]證明能阻止小泛素相關(guān)修飾蛋白（Small ubiquitin-related modifier proteins，SUMO）的?；瘉碚{(diào)控細(xì)胞的相關(guān)功能，被視為治療癌癥和神經(jīng)性疾病的潛在藥物，值得研究和開發(fā)。

除銀杏以外，漆酚酸類物質(zhì)還在槚如樹（腰果樹）、漆樹、開心果和天竺葵等經(jīng)濟作物中被分離鑒定。Schultz等[60]對漆酚酸合成進(jìn)行試驗，研究結(jié)果表明將14C標(biāo)記的檸檬酸、丙酰-CoA、油酰-CoA、醋酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸6種底物與天竺葵的毛狀體細(xì)胞共同孵育，只有油酰-CoA（C18∶1）作為有效碳源參與了漆酸的合成，而其他物質(zhì)偏向于三酰甘油的合成，來形成可儲存脂質(zhì)。因此，棕櫚油酰-CoA（C16∶1）和油酰-CoA（C18∶1）等被認(rèn)定為研究漆酚酸合成的重要前體物質(zhì)。然而，銀杏酚酸作為銀杏特有的植保素，其合成途徑及調(diào)控在分子進(jìn)化上具有特殊及保守性，目前有關(guān)銀杏酚酸合成調(diào)控的研究主要集中在脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析，而聚酮合成機制的探索以及相關(guān)基因克隆的研究報道較少，因此有待深入挖掘。

MYB和WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）家族成員基因的表達(dá)，影響有抗性效應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物的含量變化。而漆酚酸的合成關(guān)鍵限速酶是一種與酮酯酰CoA合成酶（KCS）高度同源的Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）。Eckermann等[61]研究發(fā)現(xiàn)，除草劑氯乙酰胺甲草胺（metazachlor）能使超長鏈脂肪酸（VLFAS）合成中的限速酶（酮酯酰CoA合成酶（KCS））以及Ⅲ型聚酮合成酶家族的查爾酮合成酶（CHS）和芪合酶（STS）失活。氯乙酰胺甲草胺（metazachlor）能結(jié)合在相關(guān)酶的關(guān)鍵位點半胱氨酸上，使縮合延長反應(yīng)無法正常進(jìn)行，未來對通過銀杏懸浮細(xì)胞系驗證該化學(xué)物質(zhì)是否也能使漆酚酸合成Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）失活，可進(jìn)一步明晰銀杏酚酸合成中Ⅲ型聚酮合成酶（PKSⅢ）的催化功能和調(diào)控機制。這些調(diào)控機制的逐步闡明會為低產(chǎn)或高產(chǎn)酚酸銀杏細(xì)胞株系培育提供理論與實踐指導(dǎo)。

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基金項目 國家重點研發(fā)計劃專項（2019YFD1100403，2017YFD0600701）;國家自然科學(xué)基金項目（31570682）;湖南省研究生創(chuàng)新工程和專業(yè)能力提升工程項目（CX20200733）。

作者簡介 馮致（1996—），男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué);楊竣茹，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 馮致和楊竣茹為共同第一作者。*通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2020-06-15;修回日期 2020-07-15