張向宇, 吳明聰， 孟祥祎， 張 杰

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

阿托伐他汀鈣(ATC)是他汀類藥物中一種有競爭性和選擇性的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-Co A)還原酶抑制劑[1-3]。ATC通過抑制肝臟內(nèi)HMG-Co A還原酶和膽固醇(CH)的合成從而降低血漿中CH和脂蛋白水平，并通過增加細(xì)胞表明的肝臟低密度脂蛋白(LDL-C)受體以增強LDL-C的攝取和代謝，而被廣泛使用于高脂血癥和動脈粥樣硬化臨床患者[4,5]。市售的劑型主要包括片劑，膠囊和分散片[6,7]。雖然ATC的臨床療效顯著，口服的吸收快，但會造成患者胃腸道不適，患者會出現(xiàn)視覺模糊以及味覺障礙及頭暈、皮疹等不良反應(yīng)，并且其生物利用度依然受其水溶性差和首過效應(yīng)的限制[8]。因此，研發(fā)新制劑以降低 ATC 的不良反應(yīng)并提高其療效顯得尤為迫切。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是被美國FDA批準(zhǔn)的可用于藥品生產(chǎn)的藥物載體，安全無毒，生物相容性良好[9.10]。本研究設(shè)計載ATC注射用PLGA微球，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備微球，考察微球的形貌、粒徑、化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)等性質(zhì)，評價微球的體外釋放情況，研究高血脂模型大鼠降血脂作用。通過本研究達(dá)到延長藥物作用時間、降低肝臟首過效應(yīng)作用的目的，為研制阿托伐他汀鈣微球注射制劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PLGA-COOH(聚合比例為 50:50，分子量為10000，山東省藥學(xué)科學(xué)院)；阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品(J1203AS, 大連美侖生物技術(shù)有限公司)；阿托伐他汀鈣原料藥(20180325, 武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)；聚乙烯醇(青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司)；甘露醇(沈陽市中試劑廠)；36 mm透析袋 分子量8000-14000(美國Viskase Size 5)；甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；二氯甲烷(遼寧泉瑞試劑有限公司)水為純化水；其他均為分析純。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，掃描電子顯微鏡(南京大學(xué)儀器廠)，激光粒度分布儀(島津儀器(蘇州)有限公司)，高速冷凍臺式離心機(TGL-16G-C上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 實驗動物

實驗動物由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供，SPF 級 SD 雄性大鼠50 只，185～225 g，將其飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物中心，合格證編號GYK(魯)20180007。

1.4 微球的制備

采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備在阿托伐他汀鈣微球(ATC-MSs)，取一定濃度的 PVA 溶于100 mL 純化水中作為外水相。精密稱取適量 ATC 以及 PLGA，加入到二氯甲烷( DCM) 與丙酮( ACE) 混合有機溶劑中，振搖溶解，超聲使其分散均勻，隨后加入適量純化水，在冰浴條件下，超聲得到乳白色液體，即 W/O乳液。室溫下將其緩慢滴入高速剪切的 PVA 水溶液中，得W/O/W型乳液。再加入50 mL濃度為2%異丙醇水溶液，繼續(xù)攪拌 8 h至微球固化，離心純化水洗滌微球 3次，加入適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑凍干24 h，收集，即得ATC-MSs。

2 ATC-MSs的質(zhì)量評價

2.1 ATC-MSs的形態(tài)學(xué)考察

取適量微球，用純化水溶解，放在載玻片上，光源調(diào)節(jié)至10×40，顯微鏡下觀察微球的外觀。通過掃描電子顯微鏡( SEM) 觀察微球的表面形貌，取少量制備的 ATC-MSs，在純化水中溶解，將微球用離子濺射儀進(jìn)行表面噴金處理，觀察其表面外觀形態(tài)。

2.2 ATC-MSs粒徑及粒度分布

使用激光粒度分析儀分析，將微球用純化水溶解，分散均勻，測定其粒徑及粒度分布。

2.3 ATC-MSs的紅外光譜掃描

采用傅立葉紅外光譜儀分析，稱取適量PLGA,ATC以及與空白微球與ATC的物理混合物、ATC-MSs，分別將樣品與 KBr 充分混合，壓成透明薄片。進(jìn)行 FT-IR 光譜掃描分析藥物與載體材料在制備中是否有相互作用，掃描范圍是400～4000 cm-1。

2.4 ATC-MSs差示量熱掃描的測定

通過對ATC、空白微球、ATC-MSs、空白微球與ATC的物理混合物測定，對藥物在微球內(nèi)的晶型變化與ATC的包裹狀態(tài)進(jìn)行研究。

2.5 ATC-MSs體外釋放

(1) 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈：醋酸銨緩沖液(50:50，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：247 nm；進(jìn)樣量：20 μL[16]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取ATC標(biāo)準(zhǔn)品，用含1 %吐溫80的PBS緩沖液(pH=7.4,pH=6.8)作為溶劑，配制成濃度分別為20,40,60,80,100 μg·mL-1，在247 nm波長下，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3) 精密度試驗

分別用pH7.4,pH6.8含1 %吐溫80的PBS緩沖液作為溶劑，配置濃度為20 μg·mL-1，60 μg·mL-1，100 μg·mL-1的低中高三個ATC樣品溶液，一天測定五次，計算日內(nèi)精密度。連續(xù)測量五天，每日一次，計算日間精密度。

(4) 穩(wěn)定性試驗

分別在0 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，16 h和24 h測定60 μg·mL-1ATC樣品濃度，平行測定五次，計算峰面積。

(5) 體外釋放考察

采用透析法進(jìn)行體外載藥微球的藥物釋放試驗：分為9組，其中ATC原料藥3組，PBS 緩沖液(pH=7.4)介質(zhì)下的ATC-MSs 3 組、1 %Tween-80 的 PBS 緩沖液(pH=6.8)介質(zhì)下的ATC-MSs 3 組，將微球置于處理好的透析袋中( MWCO= 8 000～14 000)，37 ℃ 100 r/min 恒溫震蕩攪拌；設(shè)定連續(xù)取樣時間，取樣量為 1 mL以待分析，同時補充等量相應(yīng)的釋放介質(zhì)。釋放樣品的濃度采用 HPLC 測定，代入標(biāo)曲計算 ATC 的累積釋放量。

2.6 ATC-MSs對高血脂模型大鼠降脂作用研究

(1) 動物分組與造模

將大鼠隨機分為 6 組：正常組、高血脂模型組、陽性對照組、阿托伐他汀鈣微球高、中、低劑量組，每組 7 只。所有大鼠均給予普通飼料、飲水自由，正常組灌服同等劑量的蒸餾水，其余 5 組灌服自制高脂乳劑，每日 1 次。2 周后，對正常組和高脂乳劑組腹主動脈取血，測總膽固醇水平，證實造模成功。

(2) 給藥方法

證實造模成功后大鼠開始藥物治療，正常組、模型組注射 10mg·kg-1的生理鹽水、陽性對照組注射同等劑量的藻酸雙酯鈉、高中、低、劑量組注射劑量分別為 20mg·kg-1,10mg·kg-1,5mg·kg-1的凍干粉。陽性對照組和空白組每日一次，連續(xù) 6 天，ATC組三天注射一次。

(3) 檢查指標(biāo)

麻醉大鼠后腹主動脈取血，將血液在4℃靜置30min，離心分離血清，按試劑盒提供的方法分別測定血液中 TC,TG,HDL-C,LDL-C,ALT,AST水平。

3 結(jié)果與討論

3.1 ATC-MSs的表征結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀察微球表面形貌，如圖1(a)，微球的外觀的形態(tài)呈現(xiàn)出良好的球形形態(tài)，較為圓整、表面平滑、無粘連出現(xiàn)。利用激光粒度分布儀測定ATC-MSs的粒徑，結(jié)果顯示微球的平均粒徑為(2.048±0.15)μm，且大小分布均勻，如圖1(b) 所示呈正態(tài)分布。

圖1(a) 微球SEM表面形貌, (b) 微球的粒度分析

3.2 阿托伐他汀鈣微球的紅外光譜測定

在400～4000 cm-1波長范圍內(nèi)掃描結(jié)果見圖 2。ATC原料藥中 3010cm-1,1601cm-1,1496cm-1是芳?xì)渖炜s振動峰，3335cm-1是酰胺中氮氫鍵的伸縮振動峰，1395cm-1是酯鍵，815 cm-1，755 cm-1是有機鹵化物F-吸收峰。在空白微球中，3420cm-1是羥基伸縮振動峰，1755cm-1是 PLGA 酯基伸縮振動峰。載藥微球中，除與ATC原料藥和空白微球共有的酯類吸收峰和羥基伸縮振動峰外，在 1625cm-1，1750cm-1處出現(xiàn)了內(nèi)酯的羰基吸收峰，說明藥物被成功包裹在微球中[11]。

圖2 微球的紅外光譜測定

3.3 差示量熱掃描測定

如圖3所示，40°C是 PLGA 的吸收峰，明顯可見有三個尖峰，分別是物理混合物、ATC-MSs和空白微球。142°C是ATC的吸收峰，明顯可見兩個尖峰是ATC和物理混合物，ATC-MSs在此處尖峰消失。說明ATC以無定形狀態(tài)分散在微球結(jié)構(gòu)中。

圖3 微球差示量熱掃描的測定

3.4 體外釋放考察

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

經(jīng)測定，pH=6.8條件下ATC的標(biāo)曲方程A=43.064C-452.55(r=0.9998)，pH=7.4條件下的標(biāo)曲方程為A=50.788C+315.55(r=0.9995)。在20.00～100.00μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好。

(2) 精密度考察

由“2.5.3”項下實驗方法測得不同pH條件下ATC的精密度，結(jié)果見表 1。不同pH條件下ATC日內(nèi)及日間精密度的RSD值均小于3 %，精密度良好，均符合方法學(xué)要求。

表1 不同pH條件下ATC內(nèi)(間)精密度測定結(jié)果(n=5)

(3) 穩(wěn)定性試驗

由“2.5.4”項下實驗方法考察ATC在不同pH PBS緩沖液中的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，ATC在不同pH的PBS緩沖液中的RSD值均小于3%。

表2 阿托伐他汀鈣穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=5)

(4) 體外釋放考察

圖4 (a) ATC標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH6.8), (b) ATC標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH7.4)

圖5 不同pH條件下ATC及ATC-MSs的體外釋放情況(n=3)

通過最佳工藝處方制備的阿托伐他汀鈣微球的載藥量為10.14±0.34 %，包封率為80.12±1.28 %，在該工藝條件下考察載藥微球的體外釋放情況。如圖4，在 pH=6.8 介質(zhì)中考察釋放情況，在 0～8 h 累積釋藥量為 46.71 %，在 24 h 累積釋藥量為 58.80%，至第 9 天累計釋藥量接近 90%，釋藥過程平穩(wěn)；在 pH7.4介質(zhì)中考察釋放情況， 0～8 h 累積釋藥量為 36.87 %，在 24 h 累積釋藥量為 47.64%，至第 9 天累計釋藥量已接近 80%，且釋藥過程平穩(wěn)。結(jié)果說明當(dāng)血脂異常體液 pH 偏低的情況下，藥物釋放情況更好。通過微球包覆，ATC釋放時間延長，載藥微球具有緩釋性能。

3.5 ATC-MSs對高血脂模型大鼠降脂作用研究

(1) 對血清脂質(zhì)水平的影響

結(jié)果圖 6(a),6 (b),6(c),6(d)所示，模型組TG,TC,LDL-C含量明顯高于正常組，具明顯差異，可證明造模成功；ATC組和陽性對照組血清中TG,TC含量較模型組有明顯降低，HDL-C含量有明顯升高；ATC高、中劑量組、陽性對照組血清中LDL-C含量與模型組比較有明顯降低。說明載ATC微球具有明顯的降血脂作用。

圖6(a)各組大鼠血清TG的比較, (b) 各組大鼠血清TC的比較，6(c) 各組大鼠血清HDL-C的比較， 6(d) 各組大鼠血清LDL-C的比較.

(2) 對血清酶水平的影響

結(jié)果圖7(a)、7(b)，ATC高、中、低劑量組大鼠與模型組相比AST與ALT顯著降低，正常組、陽性對照組相比模型組有明顯降低。說明載藥微球能有效降低模型大鼠肝脂質(zhì)水平，同時具有保護(hù)肝臟的作用[12.13]。

圖7(a) 各組大鼠血清AST的比較，7(b) 各組大鼠血清ALT的比較

4 結(jié) 論

本實驗采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備了 W/O/W 型高分子載藥微球。通過掃描電鏡、傅里葉紅外光譜分析、差示量熱儀對微球進(jìn)行質(zhì)量評價，結(jié)果表明，載阿托伐他汀鈣聚合物微球具有良好的表面形態(tài)和晶型特征。對微球藥物體外釋放的考察，本文建立了 HLPC 法測定了 ATC-MSs體外釋放度的測定方法，在 20～100ug/mL 內(nèi) ATC線性關(guān)系良好，且在 pH=6.8與 pH=7.4 的 PBS 介質(zhì)中均釋藥過程平穩(wěn)且無突釋，明顯延長了 ATC的釋放時間，達(dá)到了預(yù)期的緩釋效果。對大鼠造高血脂模，通過ATC組與模型組、陽性對照組的比較，測定血清指標(biāo)發(fā)現(xiàn) ATC-MSs具有明確降低高血脂的作用，能有效降低高血脂癥模型大鼠血清中 TC,TG,LDL-C 水平。正常組與模型組相比較結(jié)果顯示，ALT 與 AST 水平顯著下降，說明ATC-MSs 具有降血脂作用，同時保護(hù)肝臟的作用。