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        響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根總黃酮的提取工藝①

        2020-12-28 08:16:36王文婷肖慧敏韓方凱封其虎
        關(guān)鍵詞:黃酮影響

        王文婷, 肖慧敏, 馮 凡, 韓方凱, 封其虎

        (宿州學院生物與食品工程學院,安徽 宿州 234000)

        0 引 言

        牛蒡在我國主要分布于東北、西北、安徽、浙江等地,在醫(yī)學上有廣泛應(yīng)用,具有治療感冒、頭痛、咳嗽等疾病的作用[1]。牛蒡除了可以藥用,還能夠作為保健食品,其營養(yǎng)價值很高,富含礦物元素和氨基酸,因此被人們稱為蔬菜之王[2]。近年來,在功能性食品需求量不斷增加的環(huán)境下,人們對藥食性動植物的研究范圍不斷擴大,而兼具藥用性和食用性的牛蒡根也得到研究人員的重視[3]。牛蒡根是牛蒡的根部,在日常生活中,牛蒡根被作為保健蔬菜,具有降血糖、抗衰老、提高免疫力等作用[3-5]。目前,有關(guān)牛蒡根的研究也越來越多,發(fā)現(xiàn)牛蒡根中含有黃酮類、多糖類等活性成分,具有較高的自由基清除力,能夠抗氧化,同時有抑菌、消炎的作用,進一步提高了其藥用價值[4-6]。采用冷凝回流法提取牛蒡根中的總黃酮,為得到最佳提取工藝,以響應(yīng)面法進行優(yōu)化,為系統(tǒng)開發(fā)牛蒡根中的活性成分并提高其應(yīng)用價值提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料、試劑

        牛蒡根:市售,新鮮,無破損及病蟲害。

        NaNO2,Al(NO3)3,NaOH,CH3CH2OH等(西隴化工,均為分析純)。

        1.2 主要儀器、設(shè)備

        ME-T分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);RE-5000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(耀特儀器設(shè)備(上海)有限公司);JYS-M01型粉碎研磨機(九陽股份有限公司);DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱(一恒科學儀器(上海)有限公司);UV-5300型紫外可見分光光度計(元析儀器(上海)有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(鞏義予華儀器有限公司)。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 牛蒡根總黃酮提取工藝

        原料預處理:牛蒡根清洗、瀝干,切成小片,60℃烘干,粉碎以備用。

        提?。簻蚀_稱量4 g牛蒡根粉,加入適量一定濃度的乙醇溶液,將水浴鍋調(diào)至一定的溫度,冷凝回流提取一定的時間,待提取完成后抽濾,收集濾液,濃縮后溶解、定容,得牛蒡根總黃酮提取液[7]。

        1.3.2 單因素試驗設(shè)計

        在各單因素試驗中,分別準確稱量6份牛蒡根粉4 g,置于圓底燒瓶中。設(shè)定料液比(g/mL)1:10,在90℃進行冷凝回流提取2.5h,探究分析不同乙醇溶液濃度(30%,40%,50%,60%,70%,80%)對總黃酮提取效果的影響;設(shè)定料液比1:10、乙醇溶液濃度40%,進行冷凝回流提取2.5h,探究分析不同提取溫度(50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃)對總黃酮提取效果的影響;設(shè)定乙醇溶液濃度40%,在90℃進行冷凝回流提取2.5h,探究分析不同料液比(1:5,1:10,1:20,1:30,1:40,1:50)對總黃酮提取效果的影響;設(shè)定料液比1:10、乙醇溶液濃度40%,在90℃進行冷凝回流提取,探究分析不同提取時間(1 h,1.5 h,2 h,2.5 h,3 h,3.5 h)對總黃酮提取效果的影響。

        1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

        利用Box-Behnken設(shè)計原理進行響應(yīng)面優(yōu)化,得到最佳提取條件。由于料液比對總黃酮提取效果無顯著影響,故選擇另外三個因素:提取溫度、乙醇溶液濃度、提取時間作為考察條件,以黃酮提取率作為響應(yīng)值進行分析[7-9]。試驗因素及水平如表1。

        表1 試驗因素水平

        1.3.4 牛蒡根總黃酮提取率的測定

        1.3.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

        采用NaNO2-Al(NO3)3法測定[8,9]。以濃度(mg/mL)為橫坐標x,吸光度值為縱坐標y,得標準曲線方程為:

        y=10.441x+0.0047(R2=0.9994)。

        1.3.4.2 樣液總黃酮濃度的測定

        將上述提取液稀釋10倍,準確移取1 mL于25 mL容量瓶中,依據(jù)標準曲線的繪制步驟進行操作,測得吸光度,再根據(jù)標準曲線方程計算所測定的稀釋后樣液的牛蒡根總黃酮濃度。

        1.3.4.3 總黃酮提取率的計算

        式中,X:總黃酮提取率(mg/g);M:稱取的牛蒡根粉樣品質(zhì)量(g);c:稀釋后樣液總黃酮濃度(mg/mL);V:牛蒡根粉樣品提取液總體積(mL);n:稀釋倍數(shù)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 單因素試驗結(jié)果分析

        2.1.1 乙醇溶液濃度對牛蒡根總黃酮提取的影響

        由圖1可見,當乙醇溶液濃度在30%-40%范圍時,牛蒡根總黃酮的提取率隨濃度增大而不斷升高,濃度高于40%時,提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因為牛蒡根中黃酮類化合物主要以黃酮苷的形式存在,而較低濃度的乙醇溶液適合黃酮苷的提取,較高濃度的乙醇溶液適合黃酮苷元的提取[10]。因此,牛蒡根總黃酮提取的最佳乙醇溶液濃度為40%。

        圖1 乙醇溶液濃度對牛蒡根總黃酮提取的影響

        2.1.2 提取溫度對牛蒡根總黃酮提取的影響

        由圖2可見,溫度處于50℃-90℃范圍時,牛蒡根總黃酮提取率隨溫度上升而不斷增加,當溫度在90℃時,提取效果最好,當溫度繼續(xù)上升至100℃時,提取率有所降低,提取效果受到抑制??赡艿脑蚴禽^低溫度時,升高溫度利于分子擴散從而提高黃酮類物質(zhì)的溶解,但到達90℃后繼續(xù)使溫度升高,高溫會導致其穩(wěn)定性有所下降,結(jié)構(gòu)被破壞,發(fā)生分解,造成提取率下降[11]。因此,牛蒡根總黃酮最佳的提取溫度為90℃。

        圖2 提取溫度對牛蒡根總黃酮提取的影響

        2.1.3 料液比對牛蒡根總黃酮提取的影響

        由圖3可見,牛蒡根總黃酮提取率隨提取劑的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,但在一定范圍內(nèi),料液比對提取率并無太大影響,總體影響效果不明顯。在料液比為1:10時,牛蒡根總黃酮提取率達最大值,因此選擇該比例為最佳料液比,且在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中不將該因素列為操作條件進行研究。

        圖3 料液比對牛蒡根總黃酮提取的影響

        2.1.4 提取時間對牛蒡根總黃酮提取的影響

        由圖4可見,當提取時間在1.0h-2.5h范圍內(nèi)時,牛蒡根總黃酮提取率隨時間增加而升高,且在2.0h-2.5h范圍內(nèi)上升非常明顯,但當時間超過2.5 h后,提取率在一定的范圍內(nèi)維持穩(wěn)定,說明已經(jīng)提取完全,時間繼續(xù)延長對提取影響不明顯[9]。因此,牛蒡根總黃酮最佳的提取時間為2.5 h。

        圖4 提取時間對牛蒡根總黃酮提取的影響

        2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

        2.2.1 回歸模型分析

        響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計和結(jié)果如表2所示,對數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸,得到Y(jié)(黃酮提取率)對A(乙醇溶液濃度)、B(提取溫度)、C(提取時間)的二次多項式回歸模型:Y=5.67-0.030A-0.074B+0.21C+0.075AB-0.055AC+0.17BC-0.39A2-0.57B2-0.39C2。將回歸模型進行方差分析,結(jié)果如表3所示。從表3可以看出,響應(yīng)面試驗設(shè)計整體模型P值小于0.0002(具有極顯著差異),失擬項P值為0.2686(不具有顯著差異),說明方程對試驗有較好的擬合性。此外,提取時間(C)對牛蒡根總黃酮提取率有極顯著的影響,提取溫度(B)與提取時間(C)的交互作用對牛蒡根總黃酮提取率的影響顯著,各因素的二項式影響均極顯著。從數(shù)據(jù)得出R2=0.9682,說明Y的變化有96.82%與A、B、C有關(guān),擬合度較好?;貧w方程能夠較好地描述響應(yīng)面值因素之間的關(guān)系,該試驗方法可靠[12]。

        表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計和結(jié)果

        表3 回歸模型方差分析結(jié)果

        2.2.2 響應(yīng)面分析

        通過試驗分析得到不同因素交互作用對牛蒡根總黃酮提取影響的響應(yīng)面三維圖,如圖 5 所示。曲面比較彎曲陡峭代表操作條件對Y值影響很大;曲面相對平緩代表操作條件對Y值影響偏小[12,13]。因此,不同因素交互作用對提取率影響程度為:提取溫度(B)與提取時間(C)交互作用>乙醇溶液濃度(A)與提取溫度(B)交互作用>乙醇溶液濃度(A)與提取時間(C)交互作用。同時,三個因素對牛蒡根總黃酮提取率的影響程度為:提取時間(C)>提取溫度(B)>乙醇溶液濃度(A)。這與回歸模型方差分析結(jié)果吻合。通過響應(yīng)面分析,預測得到最佳的提取牛蒡根總黃酮的工藝為料液比1:10、乙醇溶液濃度39%的條件下,在溫度 88℃提取2.6 h,此時提取率為5.903 mg/g。于最佳工藝條件下提取牛蒡根總黃酮,進行驗證試驗,測得提取率為5.914 mg/g,符合預期值。

        圖5 不同因素交互作用對牛蒡根總黃酮提取影響的響應(yīng)面三維圖

        3 結(jié) 論

        通過冷凝回流法,采用單因素與響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到牛蒡根總黃酮提取的最佳工藝:料液比(g/mL)1:10、乙醇溶液濃度39%、提取溫度88℃、提取時間2.6 h,牛蒡根總黃酮提取率達5.914 mg/g。這為牛蒡根中活性成分黃酮類化合物的提取與利用提供了理論依據(jù),對其相關(guān)性質(zhì)的研究也有待更深入的探索。

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