劉煥興，蔡仲卿，沈新升，陳作喜

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨傷科，浙江 溫州 325000）

隨意皮瓣沒有軸心血管的限制，取皮的位置及方向較其他類型皮瓣更加靈活，因此被廣泛應(yīng)用于整形、創(chuàng)傷、手顯微外科等多種臨床手術(shù)的組織修復(fù)重建[1-2]。也由于隨意皮瓣內(nèi)沒有知名血管走行，其血運(yùn)主要依靠蒂部的微血管網(wǎng)供血，所以隨意皮瓣血運(yùn)較差，容易發(fā)生皮瓣缺血性壞死。特別是當(dāng)皮瓣長寬比超過2:1時(shí)，皮瓣遠(yuǎn)端極易發(fā)生壞死。這極大影響了隨意皮瓣的臨床應(yīng)用及其臨床療效。因此，尋找可以促進(jìn)隨意皮瓣存活、增加皮瓣血運(yùn)、減少皮瓣壞死面積的方法具有重要臨床意義。現(xiàn)有研究表明，中醫(yī)活血化瘀的方法有促進(jìn)微循環(huán)、改善血運(yùn)的作用[3]。中醫(yī)行氣活血的方劑中，血府逐瘀湯應(yīng)用較廣，且有研究表明其具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功效[4-5]。但是血府逐瘀湯能夠促進(jìn)隨意皮瓣存活尚未可知，本研究分析了該方對大鼠隨意皮瓣存活的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（滬）2007-0005，合格證號：2007-000548429。所有動(dòng)物在溫度為（24±0.5）℃，濕度為45%～50%，通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由同一名醫(yī)師操作。

1.1.2 藥物與試劑：血府逐瘀湯：當(dāng)歸9 g，生地9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗6 g，川穹6 g，牛膝9 g，由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。將藥材用蒸餾水浸泡1 h，水煎2次后過濾取液，煎液加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，熬制完畢，放入蒸汽滅菌鍋中滅菌，后置于4℃冰箱保存。抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體購自美國Proteintech公司，兔二抗購自北京中杉金橋公司，BCA試劑盒購自美國Thermo Fisher科技公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組：采用改良的McFarlane模型[6-7]建立大鼠隨意皮瓣：4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥位固定，剃除背部毛發(fā)，消毒鋪巾，以大鼠兩髂嵴連線作為皮瓣蒂部，向頭端方向在背部正中建立隨意皮瓣（9 cm×3 cm），切開皮膚及皮下組織，達(dá)深筋膜，分離皮下組織，掀起皮瓣，結(jié)扎知名血管后，以醫(yī)用慕絲縫線間斷縫合，創(chuàng)口周圍消毒，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由同一名醫(yī)師操作。將建立模型的大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為4組，每組18只，根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道選擇用藥濃度，相應(yīng)用藥方案如下[8]：①對照組：0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1·d-1灌胃；②血府逐瘀湯高劑量組（高劑量組）：生藥13 g·kg-1·d-1灌胃；③血府逐瘀湯中劑量組（中劑量組）：生藥6.5 g·kg-1·d-1灌胃；④血府逐瘀湯低劑量組（低劑量組）：生藥3.25 g·kg-1·d-1灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集：大鼠造模術(shù)后連續(xù)給藥7 d，每天于8：00及17：00給藥。7 d后以10%戊巴比妥鈉過量腹腔注射處死大鼠，沿皮瓣中軸線將皮瓣三等分：蒂部（I區(qū)），中部（II區(qū)），頭部（III區(qū)），切取II區(qū)中心位置的組織標(biāo)本（0.5 cm×0.5 cm）。

1.2.3 皮瓣存活面積比測量：術(shù)后1～7 d，每日觀察皮瓣存活情況并記錄。皮瓣顏色發(fā)黑、干硬、無毛發(fā)生長，考慮為皮瓣壞死；皮瓣顏色紅潤、柔軟、新鮮毛發(fā)生長，考慮皮瓣存活。第7天，大鼠在麻醉狀態(tài)下，沿皮瓣中軸線測量存活皮瓣存活面積并記錄。采用照片軟件掃描法測量皮瓣存活面積，拍攝第7天大鼠處死前的皮瓣照片，通過電腦掃描后，用Image J軟件勾勒皮瓣存活面積并計(jì)算。皮瓣存活面積比=（存活的皮瓣面積/總皮瓣面積）×100%。

1.2.4 組織學(xué)檢測：皮瓣術(shù)后第7天，取II區(qū)皮瓣標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛中固定1 d，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，HE染色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察皮瓣的肉芽組織生長、皮瓣水腫、炎性浸潤、血管新生等情況。每個(gè)組織隨機(jī)挑選6個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管橫斷面數(shù)目，計(jì)算平均數(shù)并換算為單位面積（/mm2）下的皮瓣微血管數(shù)，即微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.2.5 Western blot法檢測：術(shù)后7 d，取II區(qū)皮瓣標(biāo)本，研磨勻漿，用BCA試劑檢測蛋白濃度并配平，進(jìn)行Western blot法檢測四組標(biāo)本內(nèi)的VEGF表達(dá)量（抗大鼠VEGF濃度1:1 000，兔二抗1:10 000）。條帶用Image Lab 3.0軟件定量檢測。

1.2.6 SOD、MDA表達(dá)的檢測：術(shù)后7 d，取皮瓣II區(qū)標(biāo)本，稱取等量標(biāo)本，在冰水浴中制成體積分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液，3 500 r/min離心15 min后取上清液，按照SOD、MDA檢測試劑盒說明書，檢測各組標(biāo)本中的SOD、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)及低劑量組（P=0.019），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，對照組和各劑量組間的皮瓣存活面積、血管密度、VEGF表達(dá)量、SOD及MDA含量采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量組血府逐瘀湯對大鼠皮瓣存活面積比的影響 皮瓣術(shù)后第1天起，4組大鼠的皮瓣都出現(xiàn)不同程度的水腫，遠(yuǎn)端呈現(xiàn)暗紅色，但未出現(xiàn)明顯壞死。隨后數(shù)天內(nèi)，各組遠(yuǎn)端皮膚開始出現(xiàn)不同程度壞死，皮膚逐漸發(fā)黑、干硬、皺縮，甚至出現(xiàn)結(jié)痂，壞死組織逐漸向皮瓣蒂部發(fā)展，而各組的蒂部皮瓣皮膚皮膚紅潤、柔軟。術(shù)后第7天，壞死與存活的皮瓣組織之間的界限逐漸穩(wěn)定。血府逐瘀湯低劑量組（P=0.004）、中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P=0.007）的皮瓣存活面積比明顯高于對照組，其中中劑量組的存活面積比優(yōu)于高劑量組（P=0.043）

圖1 各組大鼠皮瓣存活面積比

2.2 不同劑量組血府逐瘀湯對大鼠皮瓣微血管生長的影響 術(shù)后第7天，大鼠II區(qū)皮瓣出現(xiàn)炎性浸潤、組織水腫、血管新生，見圖2。其中，相較于對照組的MVD值，低劑量組、中劑量組、高劑量組明顯有更多的微血管生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。不同劑量組間的比較：中劑量組的MVD較低劑量組、高劑量組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），余二組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.326），見圖3。

圖2 各組大鼠皮瓣皮下組織的HE染色結(jié)果（×200）

圖3 各組大鼠皮瓣皮下組織的MVD

2.3 不同劑量組血府逐瘀湯對皮瓣組織VEGF表達(dá)的影響 Western blot檢測顯示：與對照組相比，血府逐瘀湯低劑量組（P=0.048）、中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P＜0.001）的VEGF表達(dá)量均存在顯著差異。中劑量組VEGF表達(dá)量顯著高于低劑量組（P=0.004）、高劑量組（P=0.048），高劑量組與低劑量組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029），見圖4。

2.4 不同劑量組血府逐瘀湯對皮瓣組織SOD、MDA表達(dá)的影響 與對照組比，低劑量組（P=0.017）、中劑量組（P=0.026）、高劑量組（P=0.004）的SOD表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同劑量組之間的SOD表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組MDA表達(dá)量相比，低劑量組（P=0.026）、中劑量組（P=0.003）、高劑量組（P=0.004）的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同劑量組之間的MDA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖4 各組大鼠皮瓣的VEGF相對光密度值

表1 各組大鼠皮瓣組織的SOD及MDA含量（每組n=6）

3 討論

隨意皮瓣遠(yuǎn)端容易發(fā)生缺血性壞死，目前認(rèn)為主要與隨意皮瓣血供不足有關(guān)[1-2，9]。皮瓣主要依賴于皮瓣蒂部的微血管網(wǎng)供血，待蒂部微血管網(wǎng)的新生血管向皮瓣遠(yuǎn)端生長，遠(yuǎn)端皮瓣的缺血組織內(nèi)微循環(huán)重建后，皮瓣才能依賴其血供存活[10-11]。因此，血管新生對隨意皮瓣存活具有重要意義。同時(shí)，皮瓣組織缺血后血流再通，會(huì)引起缺血再灌注損傷，這對皮瓣存活也有重要影響。

血府逐瘀湯具有活血袪瘀、行氣止痛的功效，在中醫(yī)行氣活血法中應(yīng)用較廣。當(dāng)前文獻(xiàn)已表明，血府逐瘀湯能改善微循環(huán)，促進(jìn)血液循環(huán)[12]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示了血府逐瘀湯可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)VEGF表達(dá)[13]。因此我們將血府逐瘀湯應(yīng)用于隨意皮瓣大鼠模型，檢測其療效及相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果中，血府逐瘀湯不同劑量組的大鼠皮瓣大體存活面積均較對照組明顯改善，而不同劑量組內(nèi)的比較表明中劑量組的治療效果最佳。通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各藥物治療組的組織內(nèi)的微血管數(shù)量明顯多于對照組，而中劑量的微血管數(shù)量在各劑量組中最多，提示血府逐瘀湯確實(shí)可以促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的存活，其治療效果可能是通過促進(jìn)缺血組織內(nèi)的微血管生長，改善微循環(huán)實(shí)現(xiàn)的，而中劑量組的治療效果相較而言是其中最佳的。高劑量組的治療效果反而不如中劑量組，我們猜測可能的原因，一是該藥劑有活血化瘀的功效，劑量過高可能會(huì)引起凝血功能異常，影響皮瓣愈合，出血血腫也會(huì)影響新生血管的發(fā)生；二是過高劑量的中藥可能會(huì)引起肝腎功能損害。另外，根據(jù)文獻(xiàn)，血府逐瘀湯用于人體的常規(guī)劑量與中劑量組相近，高劑量組劑量加倍，可能劑量過高引起了不良反應(yīng)[14]。

新生血管生成與缺血組織內(nèi)微循環(huán)的重建密切相關(guān)，因此，血管新生對改善組織缺血、促進(jìn)皮瓣存活至關(guān)重要。血管新生主要分為以下步驟：原細(xì)胞連接破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞分化增值，出芽，新生血管成熟[15]。研究表明，VEFG是血管新生的關(guān)鍵因子，其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其有絲分裂及增殖分化[16]，從而促進(jìn)皮瓣內(nèi)的血管新生，增加缺血組織內(nèi)的微血管數(shù)量，加快皮瓣遠(yuǎn)端與蒂部及皮瓣與切緣之間的血運(yùn)重建，從而改善微循環(huán)，加快血運(yùn)重建。本研究表明，在皮瓣壞死區(qū)與存活區(qū)交界的II區(qū)，血府逐瘀湯治療組的MVD均增加，同時(shí)VEGF的陽性表達(dá)也增加，血府逐瘀湯可能是通過增加VEGF的表達(dá)來促進(jìn)皮瓣缺血組織的血管新生，從而改善皮瓣血運(yùn)的。其中，中劑量組相較高劑量組、低劑量組VEGF的表達(dá)量最高，同時(shí)局部MVD最大，提示中劑量組對通過VEGF促進(jìn)血管新生的療效最好。

當(dāng)缺血組織內(nèi)的微循環(huán)重建、血運(yùn)再通后，組織內(nèi)會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷，這是組織缺血后損傷壞死的重要因素[17]。缺血再灌注損傷中，氧自由基大量產(chǎn)生，與細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞。該過程中，MDA會(huì)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物生成，因此其含量可以間接反映組織的缺血再灌注損傷程度[18]。SOD可通過歧化反應(yīng)清除超氧陰離子自由基，其中內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[19]。本研究證實(shí)，血府逐瘀湯可促進(jìn)內(nèi)源性SOD的活性或增加其表達(dá)量，并減少了MDA的表達(dá)，表明該方劑可促進(jìn)氧自由基清除、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減少皮瓣的缺血再灌注損傷。

綜上所述，本研究表明血府逐瘀湯可促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的存活，其中，中劑量組治療效果最佳。其機(jī)制可能是通過促進(jìn)缺血組織內(nèi)的VEGF表達(dá)，從而增加組織內(nèi)的新生血管密度，促進(jìn)微循環(huán)重建，同時(shí)抑制組織的缺血再灌注損傷。