戴偉龍 李榮陽(yáng) 劉紅林

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

豬是生物醫(yī)學(xué)中常用的疾病模型動(dòng)物，也是肉類工業(yè)的重要?jiǎng)游镂锓N。同人生理和遺傳學(xué)的相似性使豬成為疾病模型的理想模型。例如，X連鎖原發(fā)性免疫缺陷的征狀在豬身上比在小鼠身上能夠更好的重現(xiàn)，將白細(xì)胞介素2受體亞基γ（ILRG2）破壞后，人和豬的T細(xì)胞檢測(cè)均呈陰性，B細(xì)胞陽(yáng)性，自然殺傷細(xì)胞陰性。豬肉也是肉類蛋白質(zhì)的重要來(lái)源。根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部的報(bào)告，在2017年中豬提供了超過(guò)90億kg的肉。隨著收入的增高和城市化的發(fā)展，人們的生活水平會(huì)逐漸上升，預(yù)計(jì)肉類消費(fèi)量將明顯提高。然而，目前的肉類生產(chǎn)水平難以滿足人們不斷增長(zhǎng)的需求。

通過(guò)基因工程的方法進(jìn)行遺傳改良，既可以生產(chǎn)出應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的豬模型，也能提高肉用豬的生產(chǎn)力。遺憾的是，基因工程運(yùn)用在豬身上的效率一直不高，因此限制了基因編輯豬在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，第一個(gè)攜帶基因定向修飾的基因編輯豬的報(bào)道，比第一個(gè)基因敲除小鼠晚了10多年才出現(xiàn)，而且基因編輯豬僅在少數(shù)幾個(gè)領(lǐng)域出現(xiàn)。近年來(lái)，隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，基因工程的效率得到了明顯的提高，逐漸改變了基因編輯豬的生產(chǎn)和使用模式。因此，可用于生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)的豬模型數(shù)量急劇增加。本文，我們總結(jié)了基因組編輯系統(tǒng)是如何在豬身上開(kāi)發(fā)和使用的，并討論其潛在的影響。

1 豬的傳統(tǒng)基因工程

與小鼠不同，目前還沒(méi)有建立豬多能干細(xì)胞系，導(dǎo)致制備攜帶定向修飾的基因編輯豬難度很大，從而阻礙了豬的基因研究和使用。為了建立可用于基因編輯豬生產(chǎn)的多能干細(xì)胞系，科學(xué)家們做了大量的研究，然而鮮有成功[7]。通過(guò)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（SCNT），第一個(gè)克隆哺乳動(dòng)物多莉羊的誕生，開(kāi)啟了一條不必使用多能干細(xì)胞，生產(chǎn)基因編輯豬的新途徑。概況來(lái)說(shuō)就是利用內(nèi)源性同源重組機(jī)制將定向修飾基因?qū)塍w細(xì)胞的基因組中，這些經(jīng)過(guò)基因修飾的體細(xì)胞被用作SCNT的供體，以生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物。這種方法的可行性首先在綿羊身上得到驗(yàn)證，并迅速擴(kuò)展到包括豬在內(nèi)的非嚙齒類動(dòng)物。第一次克隆豬的報(bào)道出現(xiàn)之后，這種方法被用來(lái)生產(chǎn)第一批基因敲除豬。這些基因敲除豬缺乏編碼α-（1，3）-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的糖蛋白α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（GGTA1），該基因合成半乳糖-α-（1，3）-半乳糖（α-Gal），主要功能是在異種移植后引起超急性排斥。GGTA1修飾豬為利用豬模型向異種移植的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

第一批基因敲除豬的出現(xiàn)引起了更多豬模型在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，缺乏功能性囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)（CFTR）基因的豬模型的應(yīng)用，證明了豬模型在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可適用性。該疾病的遺傳因素已被明確識(shí)別，但現(xiàn)有的CFTR嚙齒動(dòng)物模型并沒(méi)有表現(xiàn)出CFTR患者中觀察到的典型癥狀，而豬具有較好的重現(xiàn)性[11]。與GGTA1基因敲除豬類似，將CFTR的定向破壞導(dǎo)入豬體細(xì)胞的基因組中，然后利用SCNT以產(chǎn)生CFTR基因敲除豬。當(dāng)通過(guò)育種生產(chǎn)出同種豬模型時(shí)，豬（CFTR2/2）重現(xiàn)了CFTR患者的所有已知癥狀，證明了這種模型的實(shí)用性。但是由于體細(xì)胞的基因工程的效率極低，所有這些修飾都是以異種方式引入的，并且需要育種步驟來(lái)產(chǎn)生具有同種修飾的基因編輯豬?？紤]到豬的妊娠期（114d）和達(dá)到性成熟天數(shù)（6個(gè)月左右），豬的一輪育種需要1年以上的時(shí)間。如果通過(guò)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)少量的初代豬，那么需要經(jīng)過(guò)回交多個(gè)繁殖步驟，這將需要多年的育種計(jì)劃來(lái)產(chǎn)生足夠數(shù)量的基因編輯豬。此外，效率因供體細(xì)胞系的不同而有所差異。SCNT不僅高度費(fèi)時(shí)并且技術(shù)難度大。更重要的是，通過(guò)SCNT出生的豬經(jīng)常突然死亡或出現(xiàn)與SCNT過(guò)程相關(guān)的并發(fā)癥。因此，SCNT引起的相關(guān)的并發(fā)癥阻礙了通過(guò)育種來(lái)擴(kuò)大基因編輯豬模型的數(shù)量。

由于傳統(tǒng)的SCNT方法缺點(diǎn)較多，只有少量的基因編輯豬模型是通過(guò)SCNT生產(chǎn)的。因此，養(yǎng)豬界對(duì)提高基因編輯豬的生產(chǎn)效率產(chǎn)生了極大的興趣。近10年來(lái)，基因組編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用極大地改變了基因編輯豬的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)過(guò)程。

2 基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展

基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用改變了制備基因編輯豬的方法?；蚪M編輯技術(shù)的基礎(chǔ)在于它能夠識(shí)別基因組上的特定序列，并引入位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂（DSB）。由于DSB對(duì)細(xì)胞是有害的，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在這個(gè)過(guò)程中主要有兩種DNA修復(fù)途徑參與：非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）。修復(fù)途徑是一個(gè)有序的過(guò)程，每個(gè)修復(fù)途徑中都有特定的蛋白質(zhì)參與。因此，人們嘗試?yán)没瘜W(xué)抑制劑來(lái)調(diào)節(jié)NHEJ和HDR的效率。目前，有三種不同類型的基因組編輯系統(tǒng)：鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和成簇規(guī)則間隔短重復(fù)回文序列（CRISP/Cas9）系統(tǒng)。

ZFNs是第一個(gè)被開(kāi)發(fā)用于修飾哺乳動(dòng)物基因組的基因組編輯技術(shù)。在豬上，首次使用ZFNs破壞外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)將ZFNs引入GFP陽(yáng)性細(xì)胞中，導(dǎo)致GFP基因失活，并使用SCNT生產(chǎn)GFP基因敲除豬。通過(guò)在體細(xì)胞中引起GGTA1基因的定向修飾，并以該細(xì)胞作為SCNT的供體，產(chǎn)生GGTA1基因敲除豬。

與ZFNs的作用類似，TALENs能夠識(shí)別并引起特定位點(diǎn)的DSBs，從而對(duì)基因組進(jìn)行定向修飾。在選擇基因組上的靶點(diǎn)位置時(shí)，TALENs更靈活。因?yàn)門ALENs可以有效地識(shí)別富含AT的區(qū)域[15]，而ZFNs的活性則是在富含GC的靶區(qū)。2012年出現(xiàn)利用TALENs進(jìn)行基因編輯豬生產(chǎn)的首次報(bào)道。該研究表明，TALENs可以有效地在豬基因組的各個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)行靶向修飾。在基因編輯豬生產(chǎn)中，使用TALENs的另一個(gè)重要報(bào)道則是在胚胎發(fā)生過(guò)程中引起靶向修飾。然而，由于ZFNs和TALENs的組裝比較困難，這兩種基因組編輯技術(shù)并不總是表現(xiàn)出很高特異性核酸酶活性。正是由于CRISPR/Cas9技術(shù)的開(kāi)發(fā)，才大大減少了在豬體上使用基因組編輯技術(shù)所需的工作量。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬上首次應(yīng)用是在體細(xì)胞中引起定向突變。次年，有項(xiàng)研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于生產(chǎn)基因編輯豬。這兩項(xiàng)研究都將CRISPR/Cas9系統(tǒng)以mRNA形式導(dǎo)入發(fā)育中的胚胎中，通過(guò)NHEJ途徑對(duì)基因組定向引起破壞。與ZFNs和TALENs報(bào)道的較低效率相比，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接注射到豬胚胎中可以達(dá)到100%的基因修飾效率。其中一項(xiàng)研究還表明，將基因組靶向修飾的體細(xì)胞作為供體，通過(guò)SCNT成功生產(chǎn)基因編輯豬，證實(shí)了經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)修飾的體細(xì)胞在體內(nèi)仍具有發(fā)育成個(gè)體的能力。

前人研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用來(lái)有效地產(chǎn)生基因編輯豬，SCNT并不是生產(chǎn)攜帶定向修飾的GE豬的唯一途徑?；蚪M編輯系統(tǒng)的應(yīng)用，特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可以產(chǎn)生用于生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)的基因修飾豬。

3 豬模型在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

如前所述，第一批基因敲除豬被設(shè)計(jì)用于異種移植。現(xiàn)在，基因組編輯系統(tǒng)的使用允許引入對(duì)多個(gè)等位基因的編輯。使得快速生成攜帶多種遺傳修飾的基因編輯豬，以改善異種移植的豬模型成為可能。例如，利用基因組編輯系統(tǒng)（ZFNs），產(chǎn)生了缺乏GGTA1和胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）的基因編輯豬，以減少異種移植后發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以生產(chǎn)攜帶修飾的GGTA1、CMAH和β-1，4-N-乙酰-半乳糖胺酰轉(zhuǎn)移酶2（b4GalNT2）的三重基因敲除豬。來(lái)自GGTA1/CMAH/ b4GalNT2-基因敲除豬的血清中減少了與人類抗體的結(jié)合。如果使用傳統(tǒng)的基因工程方法并結(jié)合育種步驟制備這些雙重或三重基因敲除豬則通常需要花費(fèi)長(zhǎng)達(dá)幾年的時(shí)間。在異種移植領(lǐng)域使用基因組編輯系統(tǒng)時(shí)，另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是破壞了可能在異種移植后傳染給患者的豬病毒序列。有報(bào)道稱，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERVs）序列進(jìn)行全基因組破壞。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬體細(xì)胞基因組中對(duì)PERV序列的全部62個(gè)拷貝插入修飾。當(dāng)體細(xì)胞用于SCNT時(shí)，產(chǎn)生了PERV失活的基因編輯豬，從豬身上沒(méi)有觀察到健康問(wèn)題。最近發(fā)表的一篇文章表明，來(lái)自基因編輯豬的心臟可以具有非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的心臟功能，基因編輯豬的器官移植將在不久的將來(lái)可能會(huì)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段?；蚪M編輯技術(shù)的發(fā)展有助于生產(chǎn)免疫缺陷型的GE豬。缺乏免疫系統(tǒng)的動(dòng)物模型可用于疫苗的開(kāi)發(fā)，研究感染和細(xì)胞移植時(shí)的發(fā)病機(jī)制和免疫反應(yīng)。

4 基因組編輯豬在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的損失，針對(duì)該病毒的疫苗往往效果欠佳。通過(guò)應(yīng)用基因組編輯系統(tǒng)，特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用，促進(jìn)了對(duì)CD163的定向破壞，已知CD163是PRRSV發(fā)病的潛在關(guān)鍵受體。CD163基因敲除豬用于PRRSV的研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)豬對(duì)病毒完全具有抗性，將此基因編輯豬引入生產(chǎn)將顯著提高生產(chǎn)者經(jīng)濟(jì)效益。采用類似的策略，通過(guò)破壞推測(cè)的受體氨基肽酶N（ANPEP）來(lái)產(chǎn)生對(duì)傳染性胃腸炎病毒具有抗性的豬。這些研究證明，利用基因組編輯系統(tǒng)生產(chǎn)的基因編輯豬可以對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，從而顯著提高豬的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。

培育含有肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因修飾的豬也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用之一。該基因在肌肉發(fā)育過(guò)程中起著抑制肌肉發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。自然發(fā)生的MSTN突變已經(jīng)在許多物種中被識(shí)別出來(lái)，包括牛，著名的比利時(shí)藍(lán)牛和山羊。使用ZFNs或TALENs對(duì)豬的MSTN進(jìn)行靶向性破壞，可獲得更好的飼養(yǎng)效率和生長(zhǎng)速度以及更高的肌肉質(zhì)量。此外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改變豬的生理狀況，可以提高豬的生產(chǎn)力。已知解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）基因是棕色脂肪組織介導(dǎo)的產(chǎn)熱的關(guān)鍵基因，但豬通過(guò)進(jìn)化已失去其功能。通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR途徑，用功能性鼠UCP1基因替換豬內(nèi)源性UCP1基因，從而提高仔豬抵御寒冷的能力，并有助于能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。

5 總結(jié)

近些年來(lái)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展擴(kuò)大了基因編輯豬在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。使用基因組編輯系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)基因編輯豬的快速生產(chǎn)。豬的體外胚胎生產(chǎn)基因編輯豬效率已得到顯著改善，這有得益于使用直接胚胎注射的方法。這些基因組編輯技術(shù)的進(jìn)步，為基因的復(fù)雜修飾奠定了基礎(chǔ)，可以提高農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)中基因修飾豬的產(chǎn)量。