何靜 黃丹輝 董航明 蔡紹曦

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，慢性氣道疾病研究室（廣州510515）

呼吸道感染是臨床常見疾病，也是主要致死性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)，2016年下呼吸道感染在全球造成300 萬人死亡［1］。呼吸道感染的致病原復(fù)雜，除常見的細菌外，還有病毒、真菌、支原體、衣原體和軍團菌等廣義上的非典型病原體［2］。傳統(tǒng)的非典型病原體檢測技術(shù)包括涂片鏡檢和培養(yǎng)，需要專業(yè)人員耗費長時間進行分離和鑒定，且非典型病原體的培養(yǎng)條件往往較苛刻，致檢出陽性率低。新興的免疫學(xué)檢測和核酸擴增技術(shù)包括PCR 和基因芯片檢測等步驟復(fù)雜、操作要求高，且需要對樣本中可能存在的病原體進行預(yù)判，無法準確檢出混合病原體及未知病原體，難以滿足臨床及科研需求［3］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通量更高、敏感性更高、速度更快、成本更低的二代測序（next?genera?tion sequencing，NGS）技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在微生物組學(xué)的研究中，并逐漸與臨床病原學(xué)診斷相結(jié)合，為檢測呼吸道非典型病原體提供了新的思路?，F(xiàn)將目前關(guān)于NGS 技術(shù)與呼吸道非典型病原體檢測的相關(guān)研究進行綜述，并對NGS 的應(yīng)用提出問題和展望。

1 NGS 技術(shù)簡介

NGS 工作流程主要包括DNA 樣本制備、文庫構(gòu)建及驗證、大規(guī)?？寺U增和測序，使用了區(qū)別于Sanger 測序法的測序化學(xué)和單分子聚合酶鏈式反應(yīng)，使同時處理數(shù)十億個高質(zhì)量的堿基對成為可能?；贜GS 發(fā)展的感染性疾病病原體檢測技術(shù)主要包括宏基因組測序（metagenomics next?gen?eration sequencing，mNGS）、全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）以及擴增子測序（以16S rRNA和ITS測序為代表）。目前常見的NGS平臺主要有Roche 公司的454 技術(shù)、Illumina 公司的Solexa和Hiseq 技術(shù)、Helicos 公司的Heliscope 單分子測序儀和ABI 公司的Solid 技術(shù)，測序時間一般不超過48 h，最快可以在8 h 內(nèi)實現(xiàn)從DNA 樣本建庫到數(shù)據(jù)分析獲取全過程，充分體現(xiàn)其快速、高通量的優(yōu)點。

2 NGS 在感染性疾病中的應(yīng)用及優(yōu)勢

2014年WILSON 等［4］應(yīng)用NGS 技術(shù)檢出兒童腦脊液樣本中的鉤端螺旋體，這是世界上第一例臨床應(yīng)用NGS 技術(shù)診斷感染性疾病的報道，體現(xiàn)了NGS 技術(shù)在檢測非典型病原體等難分離、難培養(yǎng)致病原上的優(yōu)勢。MIAO 等［5］報道了目前中國最大規(guī)模的關(guān)于mNGS 檢測感染性疾病病原體的回顧性分析研究，共納入511 例樣本，其中255 例下呼吸道感染，發(fā)現(xiàn)mNGS 的敏感度和特異度分別為50.7%和85.7%，顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)手段，尤其在檢測結(jié)核桿菌、病毒、真菌和厭氧菌等病原體上。

《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機相關(guān)性肺炎診斷和治療指南（2018 版）》［6］指出，NGS 等分子生物學(xué)技術(shù)可以提高病原檢測敏感度，縮短檢測時間，尤其對少見和罕見病原體的診斷有重要意義。綜上所述，基于NGS 的病原體檢測技術(shù)已經(jīng)逐步在臨床診斷領(lǐng)域推廣并開始獲得認可，臨床工作者需要充分認識并選擇性地利用這項技術(shù)解決臨床問題。

3 NGS在呼吸道非典型病原體檢測中的應(yīng)用

3.1 NGS 在診斷呼吸道非典型病原體感染中的應(yīng)用病毒是呼吸道感染的常見病原體之一，具有種類多、變異快、難分離、培養(yǎng)條件復(fù)雜等特點，目前臨床上主要采用核酸檢測技術(shù)進行檢測。有研究表明，與基于PCR 的核酸檢測相比，NGS 對呼吸道病毒的檢出率更高，且能檢出被常規(guī)檢測手段遺漏的病毒［7］。YAN 等［8］報道了1 例經(jīng)mNGS 診斷的罕見人類鼻病毒（HRV）B91 呼吸道感染，該病例中多重實時PCR 技術(shù)也曾檢出HRV，但未能進一步鑒定亞型，因此被誤認為是非致病病原體。上述報道說明PCR 方法對檢測罕見突變株有一定局限性，這與PCR 需要預(yù)先設(shè)計引物有關(guān)，而NGS可以直接對臨床樣本中的病原體進行鑒定，提高了對罕見呼吸道病毒感染的診斷能力。NGS 技術(shù)鑒定新型呼吸道病毒感染的優(yōu)勢在2019年底中國武漢的新型冠狀病毒肺炎疫情中得到了充分體現(xiàn)，研究人員在五天內(nèi)完成了新型冠狀病毒的全基因組鑒定和分析，而2013年基于實時PCR 技術(shù)進行的H7N9 流感病毒鑒定則耗時1月余［9］。綜上所述，實時PCR 技術(shù)檢測具有速度快、成本低和易獲取等優(yōu)點，適合大規(guī)模人群篩查；而NGS 對呼吸道病毒的檢出率高，能進一步減少因?qū)崟rPCR 檢測假陰性導(dǎo)致的漏診，且能彌補PCR 檢測診斷罕見或新型病毒感染上的不足。

隨著廣譜抗生素和免疫抑制類藥物使用增加，呼吸道真菌感染的發(fā)病率不斷增高，而涂片鏡檢、培養(yǎng)和抗原抗體檢測等常規(guī)檢測手段陽性率較低、難以區(qū)分菌種，容易造成漏診。XIAO 等［10］報道了首例經(jīng)NGS 檢出的尖端賽多孢子菌肺炎，該病例中NGS 在28 h 內(nèi)得到檢測結(jié)果，而傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)需要耗時數(shù)天。同時，尖端賽多孢子菌的鏡下群落形態(tài)與曲霉菌相似，容易造成混淆。因此，與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比，NGS 可以更快速、準確地為呼吸道真菌感染提供病原學(xué)證據(jù)。LI 等［11］對20 例可疑感染的肺活檢組織進行研究發(fā)現(xiàn)，與組織病理學(xué)檢測相比，NGS 可以檢出更多根霉、毛霉等結(jié)合菌，這可能與NGS 樣本不需經(jīng)過研磨加工有關(guān)，從而更真實地還原呼吸道真菌群落。

支原體和軍團菌的培養(yǎng)要求較一般細菌高，培養(yǎng)陽性率低，而衣原體甚至需要采用細胞培養(yǎng)技術(shù)，通常不通過培養(yǎng)進行臨床診斷。隨著分子病原診斷技術(shù)的發(fā)展，以PCR 為基礎(chǔ)的肺炎支原體、衣原體核酸擴增技術(shù)已被批準用于臨床，為早期、快速診斷提供依據(jù)［12］，體現(xiàn)了核酸檢測技術(shù)在臨床診斷中的重要價值。而NGS 尚未用于呼吸道支原體、衣原體感染的常規(guī)檢測，其相關(guān)報道和研究較少。

李學(xué)青等［13］收集34 例重癥肺炎患兒的肺泡灌洗液進行分析，其中20 例肺炎支原體感染的mNGS 結(jié)果與血清抗體檢測結(jié)果相符，肯定了NGS檢測肺炎支原體的能力。朱榕生［14］和邱崇榮［15］各報道了1 例經(jīng)NGS 診斷的鸚鵡熱衣原體肺炎，彌補了傳統(tǒng)檢測手段在檢測少見病原體上的不足。NGS 理論上可以實現(xiàn)全面、無偏倚地檢測病原體，而PCR 技術(shù)也有其特異性高、省時等優(yōu)點，因此現(xiàn)階段在結(jié)合患者臨床癥狀初步考慮呼吸道支原體或衣原體感染可能的情況下，仍推薦使用常規(guī)檢測方法，將NGS 作為補充手段。

目前尚無NGS 用于呼吸道嗜肺軍團菌臨床診斷的報道，HUANG 等［16］2019年報道了第一例mNGS 診斷的非嗜肺軍團菌關(guān)節(jié)感染，而傳統(tǒng)培養(yǎng)手段未檢出軍團菌感染，這一報道體現(xiàn)了NGS 在檢測軍團菌屬中有很大潛力。

此外，非典型病原體容易合并細菌感染，常規(guī)檢測手段難以鑒別，而NGS 可以在單個樣本中同時鑒定多個病原體，在鑒別混合感染和多重感染中發(fā)揮重要作用。LANGELIER 等［17］在免疫功能受損的呼吸道感染病人的肺泡灌洗液中檢測出HCOV 229E、HRV?A、HHV?6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及輸血傳播型病毒等多種病毒，還發(fā)現(xiàn)了罕見的輕型鏈球菌及丙酸棒桿菌，且病毒與細菌共存可明顯加重患者的臨床癥狀。王桂禎等［18］報道了1 例多重真菌與細菌混合呼吸道感染，傳統(tǒng)鏡檢和血清學(xué)檢查均為提示呼吸道真菌感染，痰培養(yǎng)示白念珠菌，但無法明確判斷病原菌，治療效果欠佳，NGS 技術(shù)成功檢出白念珠菌、曲霉菌、肺炎鏈球菌等多種病原體，為調(diào)整治療方案指明方向。這提示免疫功能受損或重癥呼吸道感染患者可能存在傳統(tǒng)檢測技術(shù)遺漏的多重病原體感染，在抗感染治療效果欠佳的情況下可進一步行NGS 檢測。另外，有研究者提出NGS 可用于快速鑒定肺炎支原體和細菌混合感染，并證實難治性肺炎支原體肺炎中合并細菌感染的情況較少，不應(yīng)常規(guī)聯(lián)用多種抗生素，從而減少耐藥機會［19］。

3.2 NGS 用于指導(dǎo)呼吸道非典型病原體感染治療NGS 可通過檢測呼吸道非典型病原體耐藥基因突變及動態(tài)監(jiān)測感染后氣道微生物組等方法指導(dǎo)臨床抗感染治療，也有研究者利用NGS 技術(shù)研究非典型病原體感染的致病機制，為探討新的治療方法提供思路。

PARKER 等［20］對含有流感病毒的鼻咽拭子進行NGS 檢測，發(fā)現(xiàn)了抗病毒藥物耐藥性的基因組區(qū)域，結(jié)果與傳統(tǒng)PCR 法完全一致，體現(xiàn)了NGS 在檢測耐藥基因突變上的可靠性。TREBBIEN等［21］對一名免疫低下的甲型H1N1 pdm09 流感病毒感染患者進行為期6 個月的動態(tài)監(jiān)測，在首次奧司他韋治療后NGS 檢測到H275Y 奧司他韋耐藥突變（60.3%），而在第二次扎那米韋治療過程中檢測到H275Y（65.1%）、I223R（9.2%）和E119G（89.6%）等混合耐藥突變。這項研究說明免疫功能低下的流感患者在抗病毒治療過程中可能出現(xiàn)多重耐藥，而NGS 可以在檢測病原體的同時獲取耐藥信息，從而及時調(diào)整抗病毒治療方案。值得注意的是，由于目前仍缺少特定耐藥突變基因?qū)е履退幈硇偷南嚓P(guān)研究，不能關(guān)聯(lián)耐藥基因與相應(yīng)的病原微生物，臨床應(yīng)用NGS 獲取的耐藥基因信息時仍需要結(jié)合具體的臨床信息綜合判斷［22］。

HU 等［23］利用NGS 技術(shù)對一例致死性H7N9 流感病例的氣道微生物組進行全程縱向研究，發(fā)現(xiàn)抗病毒治療3 d 后H7N9 病毒的復(fù)制受到抑制，證實了抗病毒藥物的敏感性。同時，鮑曼不動桿菌和革蘭氏陰性菌主導(dǎo)了H7N9 病毒感染后的氣道微生物組，而發(fā)病9 d 后經(jīng)痰和血培養(yǎng)證實患者繼發(fā)鮑曼不動桿菌感染。因此，NGS 的動態(tài)檢測可以評價呼吸道感染的抗病毒治療效果，并揭示未來可能出現(xiàn)的繼發(fā)感染，充分解讀這些信息可能對臨床醫(yī)生選擇抗病毒藥物和優(yōu)化抗生素聯(lián)用方案有重要意義，改善患者預(yù)后。

因為NGS 的測序深度更高、覆蓋度更廣，所以與傳統(tǒng)PCR 檢測相比，基于NGS 的轉(zhuǎn)錄組測序可以在樣本量更少的情況下，更全面地描述個體或單細胞在某一特定生理條件下的基因表達情況，有助于研究疾病分子水平上的變化和發(fā)現(xiàn)新治療靶點［24］。MAN 等［25］運用NGS 技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兒童支原體肺炎患者的NK 細胞和CD8+T細胞有過度增殖和活化的現(xiàn)象，且IFNγ、PRF1、GZMB、FASL 和GNL 等細胞因子表達上調(diào)，可能在兒童支原體肺炎的發(fā)病機制中起重要作用。對呼吸道肺炎支原體感染后的這種免疫功能失調(diào)和細胞因子變化進行干預(yù)，可能是新的治療思路，但是仍需要更多研究證實。

3.3 NGS 用于呼吸道非典型病原體感染暴發(fā)監(jiān)控和調(diào)查KOTHARI 等［26］發(fā)現(xiàn)某腫瘤病區(qū)有呼吸道副流感病毒感染聚集性病例，利用NGS 技術(shù)鑒定了病毒株的親緣關(guān)系信息，追蹤傳播途徑，判斷出院內(nèi)發(fā)生了副流感病毒傳播，而這可能是通過醫(yī)護人員的互相接觸發(fā)生的。CHARPENTIER等［27］在一次卡氏肺孢子菌肺炎爆發(fā)中利用NGS 聯(lián)合多位點序列分型進行分析，發(fā)現(xiàn)NGS 可以對卡氏肺孢子菌株準確分型，描述傳播網(wǎng)絡(luò)，并提出這項技術(shù)有可能進一步確定病原體感染的可能日期及地點。綜上所述，因病毒和真菌等非典型病原體的分離培養(yǎng)要求苛刻，限制了利用菌株分型進行疫情跟蹤和分析的能力，而NGS 不依賴分離培養(yǎng)的特點使它可以更快捷、更全面地鑒定不同病原體基因型，對管理院內(nèi)感染、預(yù)防傳染等有重要意義。

由于NGS 在病毒株特征分型上的優(yōu)越性，WHO 已將全球流感病毒的NGS 數(shù)據(jù)納入監(jiān)控，作為預(yù)測下一季節(jié)流感病毒特征的參考，并在2019年基于這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果調(diào)整了甲型H3N2 流感病毒疫苗的組分［28］。

此外，NGS 還用于環(huán)境病原體檢測。自然水環(huán)境是軍團菌的主要來源，對淡水系統(tǒng)的軍團菌監(jiān)測、危害預(yù)測和風(fēng)險評估與人類健康密切相關(guān)，NGS 目前也用于評估環(huán)境軍團菌群，有研究表明其準確度優(yōu)于實時PCR 檢測技術(shù)［29］。

4 問題和挑戰(zhàn)

NGS 的推廣應(yīng)用仍有許多問題需要解決。第一，NGS 缺乏大樣本規(guī)范化研究證實其可靠性和優(yōu)越性。第二，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標準和規(guī)范的測序流程。第三，目前暫無完善的臨床應(yīng)用指南對解讀NGS 報告進行指導(dǎo)，檢測出微生物并不等于病原體感染，鑒別致病原和背景菌仍是一大難題。NGS 檢測呼吸道非典型病原體也有其局限性，如病毒往往具有較小的核酸序列，且極不穩(wěn)定、易變異、易降解，尤其是RNA 病毒，需要更高質(zhì)量的樣本儲存和運輸條件以及更精密的富集策略。而支原體、衣原體、軍團菌等胞內(nèi)感染致病原和真菌等厚壁微生物的DNA 提取效率低，使序列數(shù)和覆蓋率偏低，最終導(dǎo)致檢測敏感度下降。因此，為了在臨床推廣應(yīng)用，NGS 及其相關(guān)配套技術(shù)和條件仍需繼續(xù)優(yōu)化［30］。

盡管NGS 的臨床應(yīng)用面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，但它的發(fā)展前景是廣闊的。已經(jīng)有研究者提出了更精密的富集目標微生物核酸和去除宿主核酸策略，可以選擇性裂解宿主細胞并從臨床樣本中分離出特定生物［31］。而MYCROBIOTA 等處理平臺的開發(fā)，逐步減少了嵌合體和DNA 污染等造成的偏差，并提供了一個易于使用的生物信息學(xué)管道，可以在不需要高級生物信息學(xué)技能的情況下實現(xiàn)NGS 結(jié)果的自動化解釋［32］。新的測序儀器極大地縮短了測序流程的實際操作時間，可以在24 h 內(nèi)提供測序結(jié)果，而單個樣本的測序成本也從70 美元降低到28 美元［33］。因此，未來NGS 技術(shù)也將繼續(xù)提高測序準確度、簡化工作流程、優(yōu)化分析報告和降低成本，實現(xiàn)在臨床上的廣泛應(yīng)用。

5 結(jié)語與展望

目前NGS 檢測呼吸道非典型病原體的研究主要以病例報道和小樣本臨床研究為主，仍有待進一步的大樣本臨床研究對比分析其與傳統(tǒng)檢測手段的敏感度和特異度。NGS 技術(shù)在檢測呼吸道非典型病原體中有著巨大的潛力，目前已逐步應(yīng)用到臨床診斷、治療指導(dǎo)以及暴發(fā)調(diào)查等方面，對改善患者預(yù)后和預(yù)防易感人群感染有重要意義。雖然NGS 仍不能完全取代目前常規(guī)的非典型病原體檢測技術(shù)，但是隨著技術(shù)不斷革新和臨床應(yīng)用逐步規(guī)范，NGS 可以作為一種有效的補充手段［34］，為傳統(tǒng)檢測技術(shù)難以診斷或治療效果欠佳的病人提供參考，減少不必要的抗生素使用并改善患者預(yù)后。同時，NGS 在鑒定新型病原體、指導(dǎo)防疫工作上發(fā)揮著不可或缺的作用。在分子病原學(xué)診斷技術(shù)不斷發(fā)展的時代，NGS 將成為精準抗感染治療的關(guān)鍵技術(shù)。