徐艷芳，張金文

1 多發(fā)性硬化簡介

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由 T細胞介導的中樞神經系統(tǒng)炎癥性疾病，主要累及脊髓和大腦白質，伴有神經脫髓鞘、軸突喪失并導致不可逆殘疾，以年輕群體多發(fā)。作為最為常見的神經系統(tǒng)疾病之一，MS是年輕患者非創(chuàng)傷性神經性殘疾的首要病因。

1.1 MS發(fā)病機制 MS涉及中樞神經系統(tǒng)的慢性炎癥性脫髓鞘、少突膠質細胞的喪失、髓鞘再生。MS的主要病理過程包括炎癥階段和退行性病變階段。

神經病理學證據(jù)表明，MS病變中最早的病理變化是在沒有淋巴細胞浸潤情況下的少突膠質細胞凋亡和小膠質細胞激活，伴有繼發(fā)性脫髓鞘［1］。MS患者的殘疾是由抗原特異性免疫應答介導的炎癥反應引起的。而脫髓鞘病變中存在炎癥細胞及其分泌的分子，髓鞘抗原反應的致病性T細胞在MS中起關鍵作用，導致神經元退化。基質金屬蛋白酶（MMPs）［2］介導自身反應性T細胞向中樞神經系統(tǒng)的遷移導致中樞神經元及其髓鞘的破壞。氧化應激、缺氧和腦的低灌注可導致MS中脫髓鞘病變增加［3，4］。 MS 具有遺傳易感性。 遺傳學研究證實，MHC classⅡHLA-DRB1基因 HLA-DRB1＊15：01是MS發(fā)展的最重要危險因素，使疾病風險增加3 倍［5］。

1.2 MS動物模型 MS動物模型包括實驗性自身免疫/過敏性腦脊髓炎（EAE）模型、病毒誘導的慢性脫髓鞘疾病模型［主要為Theiler小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）感染模型］、毒素誘導脫髓鞘模型三種。單一的動物模型不能完全復制人類MS的整個異質性及其在臨床和放射學表現(xiàn)中的多樣性，也不可能充分表現(xiàn)MS的所有臨床、放射學、病理學和遺傳學特征。目前開發(fā)出的MS動物模型僅代表MS的某個或某些方面，需要根據(jù)具體的研究問題，合理選擇動物模型。

2 MS與自體造血干細胞（I/AHSCT）

I/AHSCT治療MS是利用免疫清除劑 （預處理方案）耗盡自身反應性效應細胞，然后輸注自體造血干細胞重建正常免疫功能系統(tǒng)。I/AHSCT治療后，循環(huán)自身反應性效應T細胞Th17減少，新的胸腺T細胞出現(xiàn)，調節(jié)環(huán)境恢復［6］。重建的T細胞譜系變異程度與預處理方案的強度有關。

2.1 患者選擇 I/AHSCT治療受益對象，早期認為是患有長期嚴重進行性MS的患者，其炎癥特征不突出且神經退行性變是主要的潛在機制。這類患者一般是受益的，但很少見到神經功能改善［7，8］。此外，神經功能障礙嚴重的患者發(fā)生不良事件的風險增加［9］。最近研究則側重于復發(fā)緩解型MS患者，其中具有活性炎癥特征的患者受益最大［9］。因此，目前認為I/AHSCT治療對象是復發(fā)緩解型MS患者。

2.2 移植流程 I/AHSCT治療步驟包括外周血造血干細胞的動員，通過施用預處理方案免疫消融，然后輸注造血干細胞以促進血液重建。在MS治療中，最常用的方法是環(huán)磷酰胺（Cy）+G-CSF作為動員劑，這有助于消耗淋巴細胞并減少自體反應性T細胞再輸注的概率。

目前預處理方案的最佳強度仍未確定。最常用的預處理方案是BEAM與抗胸腺細胞球蛋白（ATG）相結合［8，13，14］的中等強度方案，高強度方案因為毒性太強而被詬病。Atkins等［15］使用了高強度方案——高劑量白消安和Cy（Bu/Cy）輸注方案［15］并對白消安方案進行了幾項修改以提高耐受性。相反，Burt及其同事［7］提倡抗胸腺細胞球蛋白治療后給予Cy的低強度方案，效果良好、毒性降低且無病死率。

2.3 結果量化 MS臨床試驗中最常發(fā)生的不良結果是復發(fā)、殘疾加重，量化工具包括擴展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）、多發(fā)性硬化功能組合、MRI病變活動性、標準化的全腦容量［7，8，13-15］以及殘疾的改善［16］。

2.4 臨床試驗 I/AHSCT是MS中研究最多的干細胞治療策略。最近一項回顧性分析表明，I/AHSCT治療達到“沒有臨床癥狀”的多發(fā)性硬化患者比例（2 年時為 78%～83%）高于現(xiàn)有試驗（13%～46%）［12］。I/AHSCT治療后2年，腦容量損失顯著減慢達到接近正常老化的水平［17］。與I/AHSCT相關的死亡率在過去二十年中有所下降［18］。最近研究顯示死亡率＜5%［9］，一些試驗報告死亡率為零［7］。選擇合適的調節(jié)強度、患者人群、移植手術、移植時間和移植后護理有助于最大限度地降低移植相關死亡率的風險。

3 MS與間充質干細胞（MSC）

MSC存在于大多數(shù)組織中，其旁分泌功能在一些疾病中比傳統(tǒng)細胞替代更有治療作用，在許多組織修復中發(fā)揮重要作用。MSC移植的潛在治療益處具有自限性，需要重復給藥。

不同來源的MSC之間可能存在重要差異，這些差異影響組織來源選擇。多發(fā)性硬化的潛在生物學特點可能影響MSC功能。一些研究發(fā)現(xiàn)，從MS患者和非MS患者中分離MSC的培養(yǎng)、分化潛能、表面抗原表達和免疫調節(jié)性能差異較大［19-22］，表明自體細胞移植可能不合適。

MSC治療的最佳劑量仍然是未知的，但目前認可的劑量是每千克體重（1～2）×106個細胞，因此初級MSC不可用于臨床，需要廣泛使用擴增細胞方案。但是，擴增循環(huán)顯著減弱了修復和神經保護特性。此外，產量低限制了重復給藥。因此，需要探索新的擴增方法。

細胞制劑的類型包括混合單核細胞制劑、純化的培養(yǎng)擴增MSC、MSC衍生的神經祖細胞。骨髓單核制劑包括許多細胞類型，這種混合制劑在修復脫髓鞘和抑制炎癥以及對中風和其他疾病患者有益。一些研究使用混合/非分離細胞；也有使用純化和培養(yǎng)擴增的MSC［28］。細胞生產中需要保證嚴格的質量和安全控制，并進行表型和核型的評估、誘變測試和微生物分析。

3.1 輸注途徑 最佳的輸注途徑仍然不確定。將細胞直接注射到特定病變中對彌漫性灰質和白質受累益處不大，這是多發(fā)性硬化癥的特征。靜脈輸注更安全，大多數(shù)MSCs研究采用靜脈注射［23］。靜脈注射后，許多細胞被困在肺部，但是仍有顯著數(shù)量進入中樞神經系統(tǒng)，分布廣泛，并且可以保持數(shù)十年。

3.2 臨床試驗 目前研究認可MSC治療MS的可行性和安全性，并且沒有異位組織形成。不良反應有：短暫的無菌性腦膜炎常見于鞘內輸注；有鞘內注射MSC后急性播散性腦脊髓炎的病例報告；鞘內注射間充質、胚胎和胎兒神經干細胞組合后的膠質增生性脊髓腫瘤；3例年齡相關性黃斑變性患者的玻璃體內注射脂肪組織來源干細胞后嚴重視力喪失［27］。

MSC治療最終可能會讓位于分子治療。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么直接使用沖擊細胞中的主要效應物可以達到治療效果。MSC治療可降低促炎細胞因子如 IFN-γ［26，31］，TNF-α［30］，IL-1［31］，IL-2［32］，IL-12［33］和 IL-17［26，35，36］的 水平 ，增加抗炎因子 IL-4［28，35］，IL-5［33］和 IL-10［31］的水平。 在一些研究中發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎細胞因子IL-6的水平增加［27，32］，而一些研究中該細胞因子水平降低［36］。 此外，一些研究表明，MSC的免疫調節(jié)特性可部分歸因于具有免疫調節(jié)功能的分子的表達，如LIF［27］，PDL-1［34］，COX-2［34］，TGF-β1［34］，TSG-6［34］，CD200［34］，HGF［34，35］，IDO-1［29，34］，VEGF［35］，HLA-G［34］，HLA-E［34］和 HO-1［34］。 另一項研究［34］報道神經營養(yǎng)因子如BDNF，CNTF，GDNF，NGF 和 NTF3也由 MSC 表達，證明了這種干細胞在神經退行性疾病中支持旁分泌的潛力。另一項研究［35］證明了MSC通過抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓中的MMP-2和MMP-9活性而起作用。

免疫細胞的增殖和分化顯著受到MSC給藥的影響。用MSC治療MS導致B細胞和T細胞［34］的增殖受到抑制，并減少炎癥細胞進入中樞神經系統(tǒng)和脊髓［35］。 具體而言，MSC 治療會抑制 CD4+IFN-γ+Th1［33］和 CD4+IL-17+Th17［31］細胞在中樞神經系統(tǒng)的克隆擴增和侵入。此外，一些研究報道，MSC治療導致 CD4+IL-4+Th2［33］和 CD4+CD25+FOXP3+Treg［31］細胞克隆擴增的刺激。部分研究發(fā)現(xiàn)［27］，給予MSC后，CD44+和CD45RO+記憶T-淋巴細胞的增殖減少，先天免疫系統(tǒng)的細胞也受到MSC治療影響。MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的細胞中，CD11b+Ly6G+中性粒細胞和CD11b+Ly6C+炎癥單核細胞的百分比均降低。用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中也檢測到CD4+細胞中較低的RORγT和較高的GATA-3轉錄因子表達水平，這表明MSC處理后，Th17表型受到抑制而Th2亞群受益。Donders等［30］發(fā)現(xiàn)用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠，其樹突細胞的分化和成熟，抑制了抗原呈遞，并因此啟動T細胞免疫。Tafreshi等［34］發(fā)現(xiàn)磷酸化 GSK3β的損失可以在用MSC處理的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經元中恢復。

MSC治療后臨床條件改善，原因在于干細胞抑制了B細胞、Th1和Th17淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞的增殖和侵入中樞神經系統(tǒng)和脊髓。促炎細胞因子和生長因子IFNγ，IL-2和TGF-β分泌的減少，以及MSC分泌的抗炎因子如GM-CSF，PGE2和IL-6，也可以抑制促炎細胞如中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和CD8+T淋巴細胞的聚集及其向中樞神經系統(tǒng)的侵入。MSC中促炎性細胞因子和生長因子水平的降低以及抗炎因子的分泌也可抑制中樞神經系統(tǒng)中星形膠質細胞的活化，并刺激促炎細胞分化成M2巨噬細胞和具有免疫調節(jié)作用的Breg細胞。位于中樞神經系統(tǒng)中的促炎細胞分泌TNF-α，蛋白酶，一氧化氮和髓鞘特異性抗體也受到抑制，減少了少突膠質細胞的死亡和軸突中髓鞘的破壞。最后，通過MSC分泌神經營養(yǎng)因子如 BDNF、CNTF、GDNF、NGF 和 NTF3 也可作用于少突膠質細胞和神經元，進一步抑制疾病的進展。

4 MS與少突膠質細胞祖細胞、多能干細胞（OPC）

少突膠質細胞的主要功能是包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、協(xié)助生物電信號的跳躍式高效傳遞并維持和保護神經元的正常功能。其異常會導致中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘病變和神經元損傷。基于膠質細胞的髓鞘再生策略一直被認為是進行性MS的潛在治療方法。給髓鞘發(fā)育不良的顫抖小鼠腦內注射表達A2B5的膠質祖細胞后，導致髓鞘的廣泛形成和臨床表型逆轉。

4.1 細胞來源、移植處理 OPC主要來源于胎兒組織，由于增殖能力有限，所以能提供細胞的數(shù)量有限。誘導的多能干細胞（iPSC）可以作為少突膠質細胞的來源，因此少突膠質細胞具有使用自體細胞的可能［37］。通過CD140a和血小板衍生的生長因子α受體表型選擇，可以進一步純化這些細胞，從而產生更有效的髓鞘碎片。因為是同種異體輸注，所以需要對受體進行免疫抑制。免疫抑制劑皮質類固醇、干擾素-β和硫唑嘌呤不會影響OPC的增殖、存活或遷移能力。

4.2 臨床試驗 OPC不能從血液或腦脊液進入中樞神經系統(tǒng)實質，需要直接注射到中樞神經系統(tǒng)特定位置，其中一些細胞能夠在中樞神經系統(tǒng)內遷移相當長距離，因此雖然將細胞注射到限定位置，但仍然能夠獲得廣泛的髓鞘修復。Thiruvalluvan等［37］在動物模型中進行的研究表明，人誘導多能干細胞（hiPSC）衍生的OPC向胼胝體中的MS樣病變遷移，并使裸露的軸突髓鞘化；這種新方法表明hiPSC衍生的OPC可用于進展期的MS［37］。通過將iPSC衍生的特異性細胞移植到不同的動物疾病模型中，已經廣泛證明了iPSC的治療潛力。iPSC臨床研究需要關注的是安全性和有效性，因為某些來源于iPSC的細胞自體移植后具有引發(fā)抗原特異性免疫排斥反應的傾向。目前正在進行一期臨床試驗，以評估在繼發(fā)進展型MS患者單一時間點內注射逐步增加劑量的OPC到多個腦內位置的可行性和安全性［38］。

5 展望

現(xiàn)有證據(jù)表明I/AHSCT在抑制MS的炎癥性疾病活動方面具有實質性和持續(xù)的效果。但仍然不確定I/AHSCT治療復發(fā)緩解型MS的確切機制。受益患者應該是相對年輕的，疾病持續(xù)時間相對較短的，或者有活躍的復發(fā)緩解型MS和累積殘疾，但仍然能夠活動者。因此病例選擇也很重要。

不同組織來源的MSC特性是否相同決定了MSC的選擇。需要尋求足夠證據(jù)證明MSC不會在組織中持續(xù)存在以確定MSC移植的治療益處是自限性的，為重復給藥確立依據(jù)。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么MSC治療最終可能會讓位于分子治療。

缺乏OPC很可能不是MS中髓鞘再造不足的原因，支持和維持髓鞘再生所必需的因子缺乏或者MS病變環(huán)境中存在抑制因子，以及退化軸突不能支持髓鞘再生可能是主要障礙。因此，外源性OPC的應用可能無法滿足需要，這是未來需要解決的問題。