王煥翔，潘松蘭，楊 華，薛 倩，鄧祥熙，孫蕓琳，趙聰慧，鄒 振

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410114）

0 引言

核酸分子探針是一類建立在生物分子相互作用(如DNA/RNA雜交、DNA/蛋白質(zhì)作用等)基礎(chǔ)上，可特異性識(shí)別互補(bǔ)序列的核酸、蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)的功能寡聚核苷酸[1]。它具有設(shè)計(jì)簡便、易合成、易修飾、特異性高、自身結(jié)構(gòu)可預(yù)測等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物傳感領(lǐng)域[2-4]。1957年，F(xiàn)eisenfeld和Davies等[5]發(fā)現(xiàn)某些基因中特定的同聚嘌呤或者同聚嘧啶序列，在一定的條件下由第三條單鏈寡核苷酸 （triplex-forming oligonucleotides,TFOs）插入到雙鏈的大溝之中，通過Watson-Crick與Hoogsteen氫鍵作用形成三螺旋核酸結(jié)構(gòu)。三螺旋核酸結(jié)構(gòu)堿基的構(gòu)成具有專一性，其基本構(gòu)型由C·G-C、G·G-C、和T·A-T形成的平行三重鏈結(jié)構(gòu)以及C·G-C、G·G-C、T·A-T、和A·A-T形成的反向平行三鏈結(jié)構(gòu)組成[6]。這為三鏈核酸分子探針的研究以及實(shí)際的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。以三螺旋結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的三鏈核酸分子探針也隨之被開發(fā)應(yīng)用于生化傳感等領(lǐng)域。該文主要從影響三鏈核酸穩(wěn)定性的因素以及三鏈核酸在生化傳感中的功能應(yīng)用進(jìn)行闡述。

1 影響三鏈核酸穩(wěn)定性的因素

1.1 長度的影響

寡聚脫氧核苷酸(ODN)的長度在三鏈結(jié)構(gòu)形成的過程中是一個(gè)重要影響因素。ODN長度太短Hoogesteen氫鍵作用力太弱，不足以形成三鏈結(jié)構(gòu)，ODN長度太長容易形成核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，不利于三鏈結(jié)構(gòu)的形成。Brown課題組報(bào)道，三鏈核酸第三條核酸鏈的長度影響三鏈結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)雙鏈長度為30個(gè)堿基，第三條鏈長度為22個(gè)堿基時(shí)，能形成穩(wěn)定的三鏈核酸結(jié)構(gòu)。ODN低于或高于該22個(gè)堿基時(shí)，三鏈核酸結(jié)構(gòu)難形成[7]。

1.2 堿基序列的影響

三鏈核酸結(jié)構(gòu)各組成單元堿基序列高度匹配，堿基的錯(cuò)配、缺失會(huì)明顯的降低三鏈結(jié)構(gòu)的形成。三鏈核酸結(jié)構(gòu)的某一結(jié)合位點(diǎn)堿基發(fā)生改變，會(huì)在一定程度上導(dǎo)致第三條鏈的扭曲，無法形成三鏈結(jié)構(gòu)。在相同的條件下，由G、A構(gòu)成的ODN具有更高的親和力，能快速形成三鏈結(jié)構(gòu)。而由T、C構(gòu)成的ODN形成較為穩(wěn)定的三鏈核酸結(jié)構(gòu)所需的條件更為苛刻[8]。由此可見，序列的選擇對于三鏈的形成是不容忽視的。

1.3 堿基修飾的影響

近些年來對三鏈核酸的組成鏈進(jìn)行了大量的化學(xué)修飾，以滿足對分析檢測對象的需求。其中甲基化是堿基修飾的手段之一，一般在胞嘧啶的5位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。通過堿基修飾擴(kuò)大三鏈核酸存在的酸度范圍，而且在一定程度上提高三鏈自身的（Tm）解鏈溫度和親和常數(shù)[9]。提高三鏈自身穩(wěn)定性是甲基化所引起的疏水作用，形成過程中的熵變能證實(shí)這一觀點(diǎn)。不是所有的取代基團(tuán)都能增強(qiáng)三鏈的穩(wěn)定性。比如溴或者丙基在C堿基的5位點(diǎn)進(jìn)行修飾反而會(huì)降低三鏈的穩(wěn)定性，相同情況下在RNA中U的5位點(diǎn)進(jìn)行修飾，卻會(huì)進(jìn)一步的促進(jìn)三鏈的形成[10]。造成這種差異的可能是取代反應(yīng)過程中成鍵的電荷密度發(fā)生改變。溴電負(fù)性強(qiáng)，不僅會(huì)增強(qiáng)嘧啶鏈3位點(diǎn)電荷密度使氫鍵供體能力得到大大的提升，也會(huì)進(jìn)一步降低1位點(diǎn)電荷密度使受體能力減弱。當(dāng)這兩種效應(yīng)不對等便會(huì)削弱三鏈核酸的穩(wěn)定性。對磷酸基團(tuán)進(jìn)行甲基化修飾形成的三鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與ODN長度密切相關(guān)[11]。

1.4 溫度和pH的影響

在酸性條件下，胞嘧啶（C）質(zhì)子化，增加了C-G·C堿基對的穩(wěn)定性，促使三鏈的形成；而在中性條件下胸腺嘧啶（T）去質(zhì)子化，增加了T-A·T堿基對的穩(wěn)定，使三鏈結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定存在。酸性環(huán)境中，三鏈的穩(wěn)定性取決于第三條鏈中C堿基的比例[12]。一般根據(jù)其C-G·C/T-A·T比例的不同，可以設(shè)計(jì)不同類型的可切換三鏈核酸分子開關(guān)。從解鏈溫度（Tm）對酸度的依賴性和形成的焓變來看，質(zhì)子在三鏈解離的過程中被釋放，但其數(shù)量要少于第三條鏈中胞嘧啶的數(shù)目。這表明單鏈中胞嘧啶被部分質(zhì)子化[13]。

1.5 離子濃度的影響

由于分析檢測的多樣性，不同的離子在溶液中既能降低雙鏈和寡聚核苷酸鏈之間的排斥力，又能使核酸鏈之間的親和性發(fā)生顯著的改變。Mg2+嵌到核酸鏈中間降低局部過高的負(fù)電荷，促進(jìn)了三鏈核酸的形成[14]。Volker等[15]通過升高鈉離子濃度明顯提高了三鏈核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，當(dāng)ODN中富含T堿基時(shí)，形成的三鏈結(jié)構(gòu)比相應(yīng)的富含C所形成的三鏈對于鈉離子的濃度表現(xiàn)出更高的依賴性。這可能是由于電荷的不同所導(dǎo)致的，前者具有較高的負(fù)電荷，而后者由于C的質(zhì)子化作用使負(fù)電荷密度下降所造成的。除了鈉離子和鎂離子等陽離子外，多胺質(zhì)子化在一定程度上影響三鏈的形成。溶液中存在精胺時(shí)，有效降低局部負(fù)電荷促進(jìn)了三鏈的形成。同時(shí)Ag+通過C-G·C堿基對的絡(luò)合促進(jìn)三鏈的形成[16]。

2 三鏈核酸分子探針在生化傳感中的應(yīng)用

由于核酸序列的可設(shè)計(jì)性，三鏈結(jié)構(gòu)在核酸探針信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有巨大的優(yōu)勢。三鏈核酸探針能夠進(jìn)行熒光、拉曼、電化學(xué)生化傳感平臺(tái)的設(shè)計(jì)，用于復(fù)雜體系中生物標(biāo)志物的檢測，具有普適性、靈敏度高，特異性高的特點(diǎn)。

2.1 三鏈分子探針熒光生化傳感應(yīng)用

熒光傳感具有響應(yīng)快，檢測限低等優(yōu)點(diǎn)，是核酸探針常用的信號(hào)報(bào)告方式。傳統(tǒng)核酸探針MB(分子信標(biāo))在5’和3’修飾熒光團(tuán)和猝滅團(tuán)。遇到靶序列后，兩者分離恢復(fù)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對靶序列的檢測?；诖嗽恚琇u等設(shè)計(jì)了三鏈核酸分子開關(guān)（TMS）結(jié)構(gòu)[17]，它是由5’、3’分別標(biāo)記了FAM、BHQ 1的ptMB鏈和外加的sfO鏈組裝形成。環(huán)部設(shè)計(jì)為miRNA的互補(bǔ)序列，莖部設(shè)計(jì)為可形成三鏈結(jié)構(gòu)的T·A-T、C·G-C堿基對，通過Watson-Crick氫鍵和Hoogsteen氫鍵組成。當(dāng)遇到靶標(biāo)miRNA，TMS打開熒光信號(hào)恢復(fù)。與傳統(tǒng)分子信標(biāo)相比，TMS檢測限更低，顯著提高信號(hào)背景比（圖1）。

圖1 三鏈分子開關(guān)用miRNA檢測[17]Fig.1 Classical triplex molecular beacons for microRNA-21 detection[17]

Yang等首次提出三鏈分子探針具有分子識(shí)別單元和信號(hào)報(bào)告單元分離的優(yōu)勢。他們設(shè)計(jì)了一系列通用型三鏈核酸分子開關(guān)（TMS）平臺(tái)，用于目標(biāo)分子的高靈敏檢測和細(xì)胞成像。如圖2所示，Yang等設(shè)計(jì)了一種基于環(huán)莖部型三鏈生物傳感器平臺(tái)。Aptamer/待測物的特異性識(shí)別作用與環(huán)狀部分露出的腳趾進(jìn)行堿基配對，使三鏈結(jié)構(gòu)被拆卸，該探針開關(guān)被打開，識(shí)別單元與信號(hào)單元實(shí)現(xiàn)分離，裸露出來的第三條鏈兩端的配對堿基重新組合，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得兩端被標(biāo)記的芘分子彼此之間靠近，芘分子熒光強(qiáng)度升高，從而實(shí)現(xiàn)了三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）、α-凝血酶（α-thrombin,Tmb）與L-精氨酰胺（Largininamide,L-Arm）的檢測[17]。借助該三鏈核酸分子開關(guān)的思路，后續(xù)科研工作者也進(jìn)行了一系列的參考與改進(jìn)，用于miRNA的成像等[18]。

圖2 基于適配體三螺旋分子開關(guān)的傳感平臺(tái)設(shè)計(jì)[18]Fig.2 Design of sensing platform based on aptamer triple helix molecular switch[18]

基于上述三鏈分子探針分子識(shí)別與信號(hào)報(bào)告單元分離的優(yōu)勢，Zheng等將該策略用于細(xì)胞內(nèi)生物標(biāo)志物分析，他們設(shè)計(jì)了一種金納米粒子(AuNPs)集成可編程三螺旋分子開關(guān)(THMS)，實(shí)現(xiàn)從同質(zhì)溶液到活細(xì)胞的多個(gè)目標(biāo)的生物傳感[19]。三鏈分子探針在沒有遇到mRNA時(shí),標(biāo)記的熒光被金顆粒猝滅。遇到靶mRNA時(shí)，標(biāo)記熒光團(tuán)的核酸鏈掉落顯示熒光。結(jié)果表明，這種提出的可編程THMS可成功用于對活細(xì)胞中的多信使RNA (mRNA)進(jìn)行成像，并顯著擴(kuò)展了THMS傳感平臺(tái)的范圍（圖3）。

圖3 可編程DNA三螺旋分子開關(guān)在生物傳感中的應(yīng)用[19]Fig.3 Application of programmable DNA triple helix molecular switch in biosensing[19]

三鏈分子探針包含三鏈核酸結(jié)構(gòu)，三鏈核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受pH值調(diào)控。基于此，Zheng等[20]設(shè)計(jì)了一種基于三鏈核酸結(jié)構(gòu)的DNA四面體納米探針。與傳統(tǒng)的四面體的DNA納米探針略有不同，三鏈核酸結(jié)構(gòu)被用作重要的構(gòu)象轉(zhuǎn)換元件。由于腫瘤細(xì)胞中較低的胞外pH值，將靶向mRNA的H1和H2通過Hoogsteen氫鍵穩(wěn)定地組裝在DNA四面體的延伸短發(fā)夾形探針上，形成DNA三鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值和靶mRNA的同時(shí)滿足時(shí)，H1和H2之間觸發(fā)了雜交鏈反應(yīng)（HCR），它們從DNA三鏈體的解離中釋放出來，通過激活生成的長雙鏈DNA上的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，同時(shí)指示了目標(biāo)mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到監(jiān)測活細(xì)胞中的pH和mRNA（圖4）。

圖4 基于三鏈功能化四面體納米探針用于細(xì)胞內(nèi)pH和腫瘤相關(guān)mRNA的成像[20]Fig.4 Based on triple-stranded functionalized tetrahedral nanoprobe for imaging of intracellular pH and tumorrelated mRNA[20]

基于三鏈核酸結(jié)構(gòu)受pH調(diào)控的原理，Cui等將pH調(diào)控策略用于DNAzyme，他們設(shè)計(jì)了一種酸可切換DNAzyme納米裝置來控制活細(xì)胞中的DNAzyme活性，并在原位實(shí)現(xiàn)Zn2+、Pb2+同時(shí)可視化[21]。這種納米裝置建立在DNAzyme前體(DPs)和酸轉(zhuǎn)換三鏈DNA(SW-DNA)結(jié)構(gòu)上，在4.5~7.0的pH范圍內(nèi)精確響應(yīng)。進(jìn)入細(xì)胞之前，DPs的雜交狀態(tài)成功地使DNAzymes失活。納米裝置進(jìn)入活細(xì)胞中，SW-DNA將在溶酶體強(qiáng)酸環(huán)境中，從單鏈變?yōu)槿溄Y(jié)構(gòu)，然后與SW-DNA雜交的鏈被釋放，隨后與DPs反應(yīng)形成活性DNAzyme，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Zn2+、Pb2+同時(shí)成像。此外，該策略作為構(gòu)建各種酸可切換納米器件的強(qiáng)大平臺(tái)具有廣闊的前景（圖5）。

圖5 用于對活細(xì)胞中的多種金屬離子進(jìn)行成像的酸可切換DNAzyme納米裝置[21]Fig.5 Acid-switchable DNAzyme nanodevice for imaging multiple metal ions in living cells[21]

除了受pH影響，三鏈核酸結(jié)構(gòu)具備催化功能，Cu2+依賴的DNAzyme需要形成三鏈核酸結(jié)構(gòu)才具備切割功能?；诖耍琄uang課題組[22]構(gòu)建了一種依賴于手性的圓偏振光（CPL）活化納米組件，該組件由DNAzyme響應(yīng)的核酸分子探針和金納米棒改性的尖晶狀鉑上轉(zhuǎn)換修飾形成復(fù)合型納米顆粒（UCNPs）修飾而成，該納米結(jié)構(gòu)不僅具有良好的穩(wěn)定性，并且能同時(shí)定量分析活細(xì)胞中的多種二價(jià)金屬離子。細(xì)胞內(nèi)Zn2+，Mg2+通過DNAzyme形成的雙鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行響應(yīng)，而Cu2+通過第三條單鏈的配對形成三鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)低豐度的三種金屬離子的高靈敏檢測分析。該檢測策略的聯(lián)合使用不僅拓展了納米技術(shù)的藥物遞送以及成像研究，而且進(jìn)一步拓展了三鏈核酸分子探針與其他技術(shù)聯(lián)用的思路（圖6）。

圖6 用于細(xì)胞內(nèi)三重離子檢測的AuNR@Pt二聚體-UCNP納米平臺(tái)[22]Fig.6 AuNR@Pt dimer for intracellular triple ion detection-UCNP nano platform[22]

基于三鏈核酸的催化功能，Yang等開發(fā)設(shè)計(jì)了一種基于DNA四面體的三維3D捕獲器，用于活細(xì)胞中長非編碼RNA MEG3成像[23]，通過三鏈結(jié)構(gòu)的引入大大加速反應(yīng)進(jìn)程。其中3D捕獲器由形成三螺旋的dsDNA，能夠結(jié)合長非編碼RNA MEG3的5'端富含GA的結(jié)構(gòu)域和四個(gè)針對MEG3上連續(xù)結(jié)構(gòu)域的發(fā)夾形反義序列組成。一旦被細(xì)胞攝取，3D捕獲器形成DNA-RNADNA三螺旋結(jié)構(gòu)并觸發(fā)捕獲器的基于雜交的字符串分解來快速捕獲長非編碼RNA MEG3。由于三螺旋誘導(dǎo)的“多米諾效應(yīng)”，分解反應(yīng)時(shí)間比無法形成三螺旋的反應(yīng)要短得多。3D捕捉器可檢測長達(dá)129個(gè)核苷酸的長鏈靶標(biāo)，檢測限為0.36 nmol/L，為監(jiān)測內(nèi)源性RNA提供了可靠的策略（圖7）。

圖7 三鏈核酸驅(qū)動(dòng)的3d納米捕獲器用于細(xì)胞內(nèi)長鏈非編碼RNA MEG3的成像[23]Fig.7 Visualization of long noncoding RNA MEG3 in living cells by a triple-helix-powered 3d catcher[23]

2.2 三鏈分子探針拉曼生化傳感應(yīng)用

C.V.Raman和他的學(xué)生發(fā)現(xiàn)，單色光照射到物質(zhì)上發(fā)生散射，散射光頻率會(huì)發(fā)生改變的現(xiàn)象[24]，其中非彈性散射叫拉曼散射。Jeanmaire等發(fā)現(xiàn)分子數(shù)量相同時(shí)，電極表面的拉曼信號(hào)比溶液中的拉曼信號(hào)增強(qiáng)了6個(gè)數(shù)量級(jí)，他們指出了增強(qiáng)效應(yīng)與粗糙的表面有關(guān)，稱為表明增強(qiáng)拉曼效應(yīng)[25]。經(jīng)典的表明增強(qiáng)拉曼平臺(tái)包括貴金屬基底、拉曼報(bào)告基團(tuán)、保護(hù)層、目標(biāo)分子捕獲。拉曼信號(hào)作為信號(hào)輸出方式最大的特點(diǎn)就是高靈敏度、對樣品無影響。

結(jié)合三鏈分子探針識(shí)別單元與信號(hào)報(bào)告單元分離的優(yōu)勢，利用DNA開關(guān)設(shè)計(jì)用于制造可逆和可再生的拉曼活性底物，出現(xiàn)了以拉曼信號(hào)為報(bào)告信號(hào)的三鏈分子探針生化傳感。如圖8所示，基底由Au膜和發(fā)夾狀DNA鏈（熱點(diǎn)生成探針，HSGP）組成，并用染料官能化的銀納米顆粒（AgNPs）標(biāo)記。識(shí)別特定觸發(fā)的另一個(gè)ss-DNA用作天線。HSGP固定在Au膜上，將染料官能化的AgNP吸引到Au表面附近，并產(chǎn)生強(qiáng)的拉曼信號(hào)（SERS）。利用目標(biāo)物與天線環(huán)狀區(qū)域的特異性親和，誘導(dǎo)DNA三鏈結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)HSGP與天線的兩個(gè)臂段的雜交形成三鏈核酸結(jié)構(gòu)，染料官能化的AgNP從Au表面分離出來，實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)分子在Au膜表面的距離發(fā)生改變，產(chǎn)生SERS信號(hào)傳感響應(yīng)。與其觸發(fā)器的相互作用將天線從三鏈結(jié)構(gòu)中釋放出來，實(shí)現(xiàn)識(shí)別單元與信號(hào)單元的分離，并恢復(fù)HSGP的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，創(chuàng)建了有效的“關(guān)-開”拉曼信號(hào)可切換開關(guān)[26]。該設(shè)計(jì)表現(xiàn)出出色的可逆性，以及優(yōu)良的重現(xiàn)性和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）效果的可控性，進(jìn)一步拓展了三鏈核酸探針在SERS傳感方面的實(shí)際應(yīng)用。

圖8 DNA納米機(jī)器導(dǎo)向可逆SERS活性基板的工作原理[26]Fig.8 Working principle of the DNA nanomachinedirected reversible SERS-active substrate[26]

Zheng等利用表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象設(shè)計(jì)了一種基于適體通用放大信號(hào)檢測多個(gè)目標(biāo)分析物的方法。該方法使用ss-DNA作為通用觸發(fā)（UT）來誘導(dǎo)SERS活性熱點(diǎn)的形成[27]。SERS活性熱點(diǎn)是通過4個(gè)氨基苯硫醇（4-ABT）編碼的金納米粒子與DNA聚合物通過特定的Au-S鍵結(jié)合而形成的。適體探針與其靶標(biāo)之間的相互作用激活自組裝從而形成DNA聚合物，三個(gè)短DNA探針通過雜交鏈反應(yīng)（HCR）的方式干擾三螺旋適體/UT結(jié)構(gòu)。從而實(shí)現(xiàn)了對輸出信號(hào)的放大，同時(shí)構(gòu)建了對包括凝血酶，腺苷和CEM癌細(xì)胞的檢測成像相應(yīng)的三鏈核酸分子探針，該模型的構(gòu)建及響應(yīng)的模式進(jìn)一步激發(fā)了SERS的新設(shè)計(jì)和在生物傳感等領(lǐng)域中的應(yīng)用（圖9）。

圖9 用于檢測多個(gè)目標(biāo)分析物的具有放大信號(hào)的通用SERS檢測器[27]Fig.9 Universal SERS detector with amplified signal for detecting multiple target analytes[27]

2.3 三鏈分子探針電化學(xué)生化傳感應(yīng)用

電化學(xué)生物傳感器是快速地感應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)并將這些物質(zhì)的濃度與電流/電壓關(guān)聯(lián)起來的傳感器。具有成本低，靈敏度高，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。在過去幾十年里，構(gòu)建了許多種分析平臺(tái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測。傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感器使用單一電流信號(hào)輸出，易受到背景干擾。為避免干擾，發(fā)展了比率型電化學(xué)傳感器。Xiong等開發(fā)了電化學(xué)EDNA生化傳感器用于目標(biāo)DNA(T-DNA)檢測[28]。用亞甲基藍(lán)(MB-DNA)標(biāo)記的發(fā)夾DNA捕獲探針通過Au-S鍵錨定在金電極上。接著用兩端標(biāo)記了二茂鐵(Fc-DNA)的單鏈DNA形成三螺旋構(gòu)象。當(dāng)T-DNA存在時(shí)，F(xiàn)c-DNA與T-DNA雜交，三螺旋結(jié)構(gòu)解開并使MB-DNA恢復(fù)到其發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Fc標(biāo)記物從GE電極表面擴(kuò)散開，而MB標(biāo)記物仍然貼在它附近，導(dǎo)致Fc峰值電流降低和MB峰值電流增加。IMB/IFc值與T-DNA在0.5至80 pmol/L呈線性關(guān)系，檢測限低至0.12 pmol/L。該生化傳感器在電化學(xué)檢測多種分析物方面具有巨大潛力，可作為早期臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究的生物傳感平臺(tái)（圖10）。

圖10 用于核酸超靈敏檢測的三螺旋分子開關(guān)電化學(xué)比例生物傳感器[28]Fig.10 Triple-helix molecular switch Electrochemical Ratiometric Biosensor for Ultrasensitive[28]

相比于傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感策略，Yang等結(jié)合三鏈分子探針分子識(shí)別單元和信號(hào)報(bào)告單元分離的優(yōu)勢，利用納米孔技術(shù)設(shè)計(jì)了三鏈分子探針（TMS）用于阿爾茲海默癥生物標(biāo)志物分析[29]。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)并合成了中間鏈長度不同的三個(gè)鉗形TMS，三個(gè)TMS環(huán)部序列分別為靶標(biāo)檢測物Tau 381、AAT、BACE 1的核酸適配體序列，莖部設(shè)計(jì)為三鏈核酸序列。在沒有遇到靶標(biāo)檢測物時(shí)，TMS體積較大，不能穿過納米孔。遇到靶標(biāo)檢測物TMS解開，釋放中間的單鏈DNA。單鏈DNA體積小可以穿過納米孔，當(dāng)不同穿過納米孔的單鏈DNA序列長度不一致時(shí)，產(chǎn)生不同的阻斷電流用來分析靶標(biāo)物。利用三鏈核酸分子開關(guān)分子識(shí)別單元與信號(hào)報(bào)告單元分離的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了Tau 381、AAT、BACE1三種物質(zhì)的同步正交分析（圖11）。

圖11 基于長度編碼的三鏈分子開關(guān)納米孔的阿爾茲海默癥生物標(biāo)志物同步分析[29]Fig.11 Synchronous analysis of alzheimer's disease biomarkers based on length-encoded triple-stranded molecular switch nanopores[29]

3 結(jié)論與展望

與傳統(tǒng)的核酸探針相比，三鏈核酸探針具有特殊的穩(wěn)定性。三鏈核酸探針自身穩(wěn)定性受第三條鏈長度、堿基序列、堿基修飾、溫度和pH值、離子濃度的影響。三鏈核酸探針具有探針識(shí)別單元與信號(hào)報(bào)告單元分離、受pH調(diào)控、催化功能等優(yōu)勢。結(jié)構(gòu)可調(diào)控，有效避免了實(shí)際體系中出現(xiàn)的假信號(hào)。在實(shí)際體系疾病相關(guān)標(biāo)志物檢測中，三鏈核酸探針提供新的生物傳感方法。近年來診療一體化的理念被提出來，國內(nèi)外研究人員構(gòu)建了用于生物標(biāo)志物成像、治療的核酸分子探針。但在生物體系應(yīng)用過程中，核酸分子探針被核酸酶切割出現(xiàn)假信號(hào)，出現(xiàn)了一系列核酸分子探針穩(wěn)定性增強(qiáng)策略。三鏈分子探針具有超螺旋結(jié)構(gòu)，相比于普通分子探針可能具有更好的生物穩(wěn)定性。隨著研究的深入，三鏈核酸探針將成為生物傳感領(lǐng)域不可缺少的一部分。