王鈺婷，劉青松，張海洋，胡文杰，郭靜，彭文禹

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都）

0 引言

2019年12 月下旬，我國湖北省武漢市報道了一系列不明原因肺炎（后被命名為COVID-19），患者主要表現(xiàn)為干咳，呼吸困難，發(fā)熱和影像學(xué)上雙側(cè)肺浸潤。COVID-19 屬于中醫(yī)“疫病”范疇，大多數(shù)患者的臨床證候表現(xiàn)為濕熱郁肺，或濕毒蘊(yùn)肺，或寒濕郁肺，入里化熱，可表現(xiàn)為疫毒閉肺等證，重癥患者表現(xiàn)為內(nèi)閉外脫[1]。據(jù)其病程證候分析，清熱解毒類中藥的使用在COVID-19 治療過程中具有重要作用。

金銀花、貫眾是臨床常用清熱解毒藥對。已有研究表明，金銀花、貫眾有很好的抗病毒療效[2]。一項基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)統(tǒng)計新型冠狀病毒肺炎63 個預(yù)防方劑和中成藥的研究發(fā)現(xiàn)，金銀花、貫眾為治療COVID-19 使用的高頻藥物[3]。金銀花既能清熱解毒、又具輕宣疏散之性，能清解溫?zé)嵋叨局啊，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明金銀花有良好的抗病毒、抑菌抗炎、解熱等作用[4]。貫眾具有清熱解毒、涼血止血的功效，自古以來即在預(yù)防瘟疫藥物中有較高的地位?，F(xiàn)代藥理研究表明綿馬貫眾對流感病毒(FM1 株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抗病毒作用[5]。

金銀花-貫眾在COVID-19 的預(yù)防及治療中占有一定地位，但其作用機(jī)制不明確仍需進(jìn)一步探討。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，揭示中藥及其復(fù)方治療疾病多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其整體性、系統(tǒng)性、動態(tài)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、 組方配伍的原則不謀而合，在推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討金銀花-貫眾藥對治療CIOVID-19的可能作用機(jī)制，以期為金銀花-貫眾藥對治療CIOVID-19提供進(jìn)一步深入研究的資料。

1 材料與方法

1.1 金銀花-貫眾有效活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測

以“金銀花”，“貫眾”為關(guān)鍵詞，通過TCMSP（https://www.tcmspw.com/tcmspsearch.php/）檢索，以藥物口服生物利用度（OB ≥30%）及類藥性指數(shù)（DL ≥0.18）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得藥物成分及其靶點(diǎn)蛋白。上傳Uniprot 數(shù)據(jù)庫 （http://www.uniprot.org/）對上述靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行矯正及去重。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

通 過GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.genecards.org/），OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/），以“novel coronavirus”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得COVID-19 相關(guān)基因。將上述基因靶點(diǎn)與金銀花-貫眾藥對潛在靶點(diǎn)篩選出共同基因，利用R 軟件3.6.2 制作韋恩圖。

1.3 金銀花-貫眾治療COVID-19 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述得到的藥物活性成分, 共同基因?qū)隒ytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建金銀花-貫眾藥對治療COVID-19的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)分析

將1.2 得到的共同基因上傳String 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/），設(shè)置蛋白物種為“homo sapiens”，限定置信指數(shù)為0.4，隱藏游離蛋白，得到蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖；將蛋白互作關(guān)系TSV 格式文件保存，利用R 軟件3.6.2 計算主要蛋白之間的互作次數(shù)，并篩選出金銀花-貫眾藥對治療COVID-19排名前20 的核心靶點(diǎn)，構(gòu)建相關(guān)條形圖。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

使用R 軟件3.6.2 篩選P值≤0.05 的顯著途徑，對疾病與藥物交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析和KEGG 通路注釋分析，生成柱狀圖和KEGG 通路圖，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，預(yù)測金銀花-貫眾治療COVID-19 的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 金銀花-貫眾活性成分和潛在靶點(diǎn)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)檢索，以O(shè)B ≥30% 且和DL ≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選后得到金銀花19 種活性成分包括quercetin、luteolin、beta-sitosterol 等，貫眾7 種活性成分Harmonyl、11-Hydroxynumantenine 等。其中山柰酚（kaempferol）為金銀花、貫眾共有活性成分。

2.2 COVID-19 潛在靶點(diǎn)

通過以“novel coronavirus”為檢索詞，分別在GeneCards，OMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，共收集到COVID-19 潛在基因靶點(diǎn)309 個，與金銀花活性成分潛在靶標(biāo)進(jìn)行對比，共有43 個共同基因靶點(diǎn)。

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將藥物的主要成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 構(gòu)建活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)分別代表疾病、藥物及其活性成分、對應(yīng)基因靶標(biāo)，其中山柰酚（kaempferol）為金銀花、貫眾共有活性成分。通過分析成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，得到該網(wǎng)絡(luò)中與靶點(diǎn)關(guān)系最為密切的前四種化合物，分別為：山柰酚（Kaempfero）、槲皮素（Quercetin）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述43 個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，得到蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖，1 個節(jié)點(diǎn)代表1 個基因蛋白，按照節(jié)點(diǎn)的多少，導(dǎo)入R 軟件3.6.2，通過計算得到排名前二十的基因靶點(diǎn)條形圖，包括白介素家族（IL1B、IL2、IL4、IL6、IL10、CXCL8）、CCL2、IFNG、絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPK1、MAPK8、MAPK14）等，這些基因靶點(diǎn)可能在金銀花-貫眾治療COVID-19 中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

2.5 靶點(diǎn)基因GO 富集分析

使用R 軟件對金銀花- 貫眾藥對與COVID-19 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，共富集出79 個GO 條目（P≤0.05），選取P值最小的前15 個GO 條目作氣泡圖，由此推出，金銀花-貫眾主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、趨化因子活性，MAP 激酶活性、抗氧化活性等生物學(xué)過程而發(fā)揮治療作用。

2.6 KEGG 通路富集分析

通過R 軟件進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共富集出146 條信號通路（P≤0.05），篩選出富集基因數(shù)較多的前20 條通路，其中可能與COVID-19 有關(guān)的信號通路主要包括：IL-17信號通路、Toll 樣受體信號通路、C- 型凝集素受體信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等炎癥相關(guān)信號通路；甲流、乙肝、麻疹、巨細(xì)胞病毒等病毒相關(guān)通路；百日咳、肺結(jié)核等細(xì)菌相關(guān)通路；美國錐蟲病、弓形蟲病等寄生蟲相關(guān)通路；HIF-1 信號通路等。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，炎癥相關(guān)通路、HIF-1 信號通路可能在金銀花-貫眾治療COVID-19 發(fā)揮著重要作用。

3 討論

COVID-19 爆發(fā)至今，我國在2019 新冠肺炎疫情戰(zhàn)中采取了一系列嚴(yán)格徹底的防控措施，不僅為世界新冠疫情控制爭取了時間，也為各國新冠疫情戰(zhàn)爭提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。當(dāng)前各國新冠肺炎疫苗在緊張的研制中，至今仍未發(fā)現(xiàn)治療的特效藥，我國專家據(jù)我國疫情情況，在阻擊疫情過程中合理、辨證的使用中醫(yī)藥，有效的改善了COVID-19 的預(yù)后率。COVID-19 的發(fā)病與外感疫厲之邪相關(guān)，金代劉完素所著《傷寒直格》云 :“傷寒六經(jīng)傳受，自淺至深，皆是熱證，非有陰寒之病”，提出“六氣皆從火化”的理論，由此佐證，火熱、火毒在COVID-19 病程中發(fā)揮著重要的作用，故金銀花-貫眾等清熱解毒類中藥在臨床使用頻次較高。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對金銀花-貫眾主要有效成分進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)篩選，共篩選出金銀花19 種活性成分，貫眾7 種活性成分，根據(jù)成分-靶點(diǎn)的作用關(guān)系，篩選出作用較強(qiáng)的4 個化合物：山柰酚、槲皮素、木樨草素、β-谷甾醇。山奈酚具有抗氧化活性，可清除氧自由基，也可通過降低MAKP 信號通路的活性來抑制TNF、IL-6、IL-10、IL-1β 等的表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善因組織缺氧引起的損傷[7-8]。槲皮素可減輕肺組織的水腫和病理損傷，抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。槲皮素除激活自噬活性外，還通過抑制促纖維化因子和AKT/mTOR 信號通路顯示抗纖維化活性。β-谷甾醇可以抑制NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，可能是其減輕急性肺損傷的機(jī)制之一。木犀草素通過對MAPK 激活，p65 激活，對p65 易位和與DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)抑制，抑制NF-κB-DNA 結(jié)合活性。綜上金銀花-貫眾主要活性成分具有抗病毒、抗炎、抗肺纖維化和調(diào)節(jié)免疫等功能，從而起到治療和預(yù)防COVID-19 的作用。

篩選出金銀花-貫眾治療COVID-19 的直接靶標(biāo)43 個，通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)白介素家族（IL1B、IL2、IL4、IL6、IL10、CXCL8）、CCL2、IFNG、絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPK1、MAPK8、MAPK14）、PTGS2 等靶點(diǎn)可能是金銀花-貫眾治療COVID-19 關(guān)鍵靶標(biāo)。白介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，具有傳遞信息、激活或免疫調(diào)節(jié)等功能。IL-1B 主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有上調(diào)促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌的功能，并具有誘導(dǎo)環(huán)氧合酶（COX）-2 表達(dá)的作用。COVID-19 與Toll 樣受體（TLR）結(jié)合導(dǎo)致pro-IL-1B 的釋放，并被caspase-裂解，隨后活化并產(chǎn)生成熟的IL-1B，IL-1B 能介導(dǎo)肺部的炎癥、發(fā)熱和肺纖維化，并引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。亦有實(shí)驗(yàn)證明，IL-1B 是驅(qū)動肺損傷患者支氣管肺泡灌洗液促炎活性的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-6 在機(jī)體的抗感染免疫中起著重要的作用，有研究表明，COVID-19 危重患者的炎癥細(xì)胞因子IL-6 水平顯著升高。IL-10 表達(dá)的增加會誘導(dǎo)膠原蛋白的產(chǎn)生和向肺中募集纖維細(xì)胞，與肺纖維化相關(guān)。CCL2 是能夠趨化細(xì)胞定向移動的小分子細(xì)胞因子，在參與炎癥反應(yīng)、病原體感染、創(chuàng)傷修復(fù)inflammation, proliferation, and remodeling. An alteration at any stage may lead to the development of chronic non-healing wounds or excessive scar formation. Impaired wound healing presents a significant health and economic burden to millions of individuals worldwide, with diabetes mellitus and aging being major risk factors. Ongoing understanding of the mechanisms that underly wound healing is required for the development of new and improved therapies that increase repair. Chemokines are key regulators of the wound healing process. They are involved in the promotion and inhibition of angiogenesis and the recruitment of inflammatory cells, which release growth factors and cytokines to facilitate the wound healing process.Preclinical research studies in mice show that the administration of CCL2, CCL21, CXCL12, and a CXCR4 antagonist as well as broad-spectrum inhibition of the CC-chemokine class improve the wound healing process. The focus of this review is to highlight the contributions of chemokines during each stage of wound healing and to discuss the related molecular pathologies in complex and chronic non-healing wounds.We explore the therapeutic potential of targeting chemokines as a novel approach to overcome the debilitating effects of impaired wound healing.”,”container-title”:”International Journal of Molecular Sciences”,”DOI”:”10.3390/ijms19103217”,”ISSN”:”1422-0067”,”issue”:”10”,”journal Abbreviation”:”Int J Mol Sci”,”language”:”eng”,”note”:”PM ID: 30340330 PMCID: PMC6214117”,”source”:”PubMed”,”ti tle”:”The Role of Chemokines in Wound Healing”,”volume”:”19”,”author”:[{“family”:”Ridiandries”,”given”:”Anisyah”},{“family”:”Tan”,”given”:”Joanne T. M.”},{“family”:”Bursill”,”given”:”Christina A.”}],”issued”:{“date-parts”:[[“2018”,10,18]]}}}],”schema”:”https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json”} 及腫瘤形成等病理過程中發(fā)揮著重要作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，CCL2 參與抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞募集至致敏和小鼠肺損傷。干擾素是一類具有抗病毒，抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的低分子糖蛋白質(zhì)，是機(jī)體抗病毒感染的第一道天然免疫防線，現(xiàn)主要分為I 型、II 型、III 型，其中I 型又分為INF-α 和INF-β，已有實(shí)驗(yàn)證明，IFN-β1a 對SARS-CoV有很好的抑制作用。由于機(jī)體在遭受病原體入侵或毒素刺激時，體內(nèi)炎癥細(xì)胞會釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞毒素，內(nèi)源性炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-8、TNF-α 等進(jìn)入循環(huán)可能產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，據(jù)報道白介素、干擾素、趨化因子可能在細(xì)胞因子風(fēng)暴中發(fā)揮著核心的作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一族在真核生物中廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)宿主對感染的免疫反應(yīng)，能被多種病毒激活。PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2）即環(huán)氧合酶2（COX-2），主要在炎癥組織中由細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生。在外界刺激因子的作用下，COX-2 促使炎癥介質(zhì)前列腺素的合成并引起炎癥反應(yīng)、發(fā)熱和疼痛，催化花生四烯酸（AA）轉(zhuǎn)化為病理性前列腺素（PGs）。病毒感染會刺激COX-2mRNA 的積累，蛋白質(zhì)表達(dá)和PGE2 的產(chǎn)生，參與調(diào)節(jié)宿主對感染的反應(yīng)、病毒的復(fù)制生命周期或增強(qiáng)病毒感染的機(jī)制。

KEGG 富集結(jié)果顯示，金銀花-貫眾治療COVID-19 可能與IL-17 信號通路、TNF 信號通路、甲型流感、Toll 樣受體信號通路、C 型凝集素受體信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路等信號通路有關(guān)。其中Toll 樣受體信號通路（TLRs）可識別不同的病原體相關(guān)分子模式，是抵御病原體入侵的第一道防線。TLR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來源于細(xì)胞內(nèi)Toll/IL-1 受體(TIR)的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與TIR 結(jié)構(gòu)域包含的接頭蛋白MyD88 發(fā)生相互作用，經(jīng)過配體的刺激，MyD88將IL-1 受體相關(guān)激酶-4(IRAK-4)吸引到Toll 樣受體，從而激活MAP 激酶(JNK,p38MAPK) 和NF-κB。TNF 是一種糖蛋白，由TNF-α、TNF-β 組成，胞外因子TNF-α 以三聚體形式發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，與TNF 受體（TNFR）結(jié)合引起受體多聚化，這種多聚化使得TNF 受體與細(xì)胞質(zhì)中TRADD 分子發(fā)生相互作用，TRADD 招募相應(yīng)蛋白通過TRAF2 和RIP 分子激活NF-κB 信號通路。NF-κB 負(fù)責(zé)編碼促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄。由此得出NF-κB 可能在金銀花-貫眾治療COVID-19 信號通路中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而介導(dǎo)下游IL-6、IL-1B 等炎癥因子的釋放。HIF-1（缺氧誘導(dǎo)因子1）是一種可響應(yīng)細(xì)胞環(huán)境中可用氧變化的重要轉(zhuǎn)錄因子。它有兩個亞基，HIF-1α 和HIF-1β，HIF-1α 受氧狀態(tài)調(diào)節(jié)在缺氧條件下積累表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 缺乏會通過促進(jìn)II型肺泡上皮細(xì)胞自噬來增強(qiáng)甲型流感病毒的復(fù)制。

綜上所述，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對金銀花-貫眾治療COVID-19 的分子機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，金銀花-貫眾中的山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）可能通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路等通路作用于IL1B、IL6、IL10、CXCL8、CCL2、IFNG、PTGS2 等作用靶點(diǎn)發(fā)揮抗病毒、抗炎、抗缺氧等作用來治療COVID-19，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供一定的理論依據(jù)。