張旺，王偉林

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 杭州）

0 引言

胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤疾病，其起病隱匿，病死率高，預(yù)后極差。胰腺癌有多種分類，其中85% 左右均為胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）[1]。近年來盡管胰腺癌的治療手段有了較大的進(jìn)展，除手術(shù)治療技術(shù)不斷發(fā)展外，術(shù)前術(shù)后放化療方案也有了進(jìn)一步的完善，另外還可以結(jié)合分子靶向治療加強(qiáng)療效，但胰腺癌的治療仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，其生存預(yù)后仍未能明顯改善，5 年生存率僅約7%[2]。在未來數(shù)十年內(nèi)，胰腺癌將成為西方國家腫瘤相關(guān)死亡率的第二大原因[3]。而在中國，盡管目前胰腺癌發(fā)病率及病死率未排入前五名，但隨著中國人群生活方式逐漸西方化，胰腺癌發(fā)病率正在逐漸上升[4]。因胰腺癌在疾病早期常無明顯臨床癥狀，且疾病進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于腫瘤晚期，僅約20%的患者在確診時(shí)仍有手術(shù)切除機(jī)會(huì)[5]。而即使在可手術(shù)切除的患者中，也有許多在術(shù)前就存在著腫瘤微轉(zhuǎn)移灶，因此盡管外科手術(shù)已完整切除病灶，患者術(shù)后也有極高的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。胰腺癌的不良預(yù)后由許多因素共同導(dǎo)致，其中胰腺癌對(duì)化療藥物的耐藥性扮演著重要角色。目前手術(shù)切除聯(lián)合系統(tǒng)性化療是唯一有機(jī)會(huì)延長胰腺癌患者生存期的方法，而實(shí)際上在許多胰腺癌患者中都可以觀察到對(duì)以吉西他濱為主的化療藥物的耐藥性[6]。

胰腺癌的化療藥物耐藥性部分是由于患者黏蛋白（mucin）的表達(dá)異常導(dǎo)致的。黏蛋白是在機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一類糖蛋白，它的異常表達(dá)會(huì)在細(xì)胞外形成網(wǎng)格狀的屏障，從而阻止化療藥物到達(dá)靶向部位[7-11]。目前已有許多研究關(guān)注黏蛋白與胰腺癌的相關(guān)性，卻少有研究去探索黏蛋白合成過程中的催化酶在胰腺癌中所起的作用。其中由GCNT3 基因編碼表達(dá)的GCNT3 蛋白，即β-1，6-N- 乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（beta 1，6 N-acetylglucosaminyltra nsferase），是參與黏蛋白合成過程中起著重要作用的酶類之一，GCNT3 蛋白的活性影響著機(jī)體許多重要的生理過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等[12]。GCNT3 的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致黏蛋白的過度表達(dá)，形成異常的分子屏障，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺癌的不良預(yù)后和化療藥物耐藥性[13-16]。本文旨在闡述GCNT3 在胰腺癌中的研究進(jìn)展，以求探索提高胰腺癌治療效果，改善預(yù)后的新途徑。

1 黏蛋白與GCNT3

黏蛋白（mucin）主要由糖類和蛋白質(zhì)組成，是一類包含許多亞型的高分子量糖蛋白家族。目前已發(fā)現(xiàn)21 種人類黏蛋白，分別命名為MUC1-MUC21，共分為分泌型和跨膜型黏蛋白兩大類[17]。其中跨膜型黏蛋白主要包括MUC1、MUC12、MUC13 等，它們?cè)诩?xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間相互作用等一系列生理過程中起著重要作用。分泌型黏蛋白主要包括MUC2、MUC5、MUC6 等，它們的主要作用是參與形成粘膜層，覆蓋在上皮細(xì)胞表面，保護(hù)上皮組織免受炎癥、感染等不利因素的損傷[18]。當(dāng)前已有許多研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移等有著密切的關(guān)系，通過多種途徑導(dǎo)致許多惡性疾病[12]。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，當(dāng)前已有研究表明跨膜黏蛋白的過表達(dá)可能通過破壞上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間相互作用，進(jìn)而破壞細(xì)胞間的緊密連接和黏附作用，促進(jìn)EMT 的發(fā)生，使腫瘤細(xì)胞具備干細(xì)胞樣的特征和侵襲能力[17,19-21]。黏蛋白家族具備眾多亞型，在人體各種生理過程中扮演著復(fù)雜而重要的角色，這一特點(diǎn)決定了一種黏蛋白可在多種惡性腫瘤中起著推動(dòng)作用，而在同種腫瘤中也可存在多種黏蛋白亞型的異常表達(dá)。例如Jonckheere N 等人在卵巢、乳腺、肺、結(jié)腸等惡性腫瘤標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)了MUC1 的過表達(dá)[10]。而僅在胰腺癌中就可發(fā)現(xiàn)多種黏蛋白的過表達(dá)，包括MUC1、MUC4 和MUC16，另有研究發(fā)現(xiàn)，MUC1的過表達(dá)與胰腺癌患者總體生存期縮短相關(guān)[9，10，12]。黏蛋白的功能復(fù)雜多樣，大部分黏蛋白都被發(fā)現(xiàn)與腫瘤生長相關(guān)，然而并非完全如此。MUC2 是消化道粘膜層的主要組成部分，Velcich A 等在MUC2 基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)在外界不利因素的刺激下，MUC2的缺失與腸道上皮細(xì)胞增殖相關(guān)，出現(xiàn)腸道上皮形態(tài)及細(xì)胞遷移異常，小鼠更易發(fā)展為腸道惡性腫瘤，提示MUC2 具有抑制腫瘤生長的保護(hù)作用[22]。除此之外，黏蛋白還用于指導(dǎo)腫瘤的診斷與檢測(cè)，卵巢癌相對(duì)特異性腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原CA125 即是黏蛋白亞型之一，MUC16。MUC16 在約80%的卵巢上皮性腫瘤中可出現(xiàn)過表達(dá)，升高的MUC16 可在患者血清中被檢測(cè)到，目前廣泛應(yīng)用于臨床卵巢癌的早期檢測(cè)[23,24]。

大部分黏蛋白核心聚糖成分為O-連接型聚糖，包括N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）等成分，其中GalNAc 包含8 種核心結(jié)構(gòu)，分別命名為核心結(jié)構(gòu)1-8（Core1-8）。GCNT3 基因位于15 號(hào)染色體q22.2 區(qū)域，包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，其表達(dá)產(chǎn)物GCNT3 蛋白便是催化O-連接型聚糖合成過程中的關(guān)鍵酶之一，可分別催化Core1 和Core3 轉(zhuǎn)化為Core2和Core4，促進(jìn)黏蛋白核心聚糖的形成[12,25]。通常情況下GCNT3主要在消化道內(nèi)高表達(dá)，催化合成黏蛋白為上皮細(xì)胞提供保護(hù)作用，有研究發(fā)現(xiàn)GCNT3 基因敲除的小鼠模型會(huì)出現(xiàn)消化道內(nèi)黏膜屏障功能減弱[26]。而GCNT3 的異常表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致黏蛋白的異常合成，最終增加腫瘤細(xì)胞流動(dòng)性，使其在腫瘤微環(huán)境中生存能力增強(qiáng)[12，14，27，28]。除胰腺癌之外，目前已有研究發(fā)現(xiàn)GCNT3 的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤相關(guān)。Qian Li 等人研究發(fā)現(xiàn)，GCNT3 在非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）細(xì)胞中存在過度表達(dá)，且與腫瘤不良預(yù)后顯著相關(guān)[29]。而Liu T 等人在肝癌細(xì)胞系及其原位異體種植腫瘤中亦發(fā)現(xiàn)GCNT3 表達(dá)升高[30]。此外，GCNT3 還在腎透明細(xì)胞癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)量升高[12，31，32]。然而在另一些惡性腫瘤中，GCNT3卻表現(xiàn)出抑制腫瘤生長進(jìn)展的活性。Huang MC 等人研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞的GCNT3 表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、黏附，降低細(xì)胞侵襲性，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中上調(diào)GCNT3 的表達(dá)則可抑制腫瘤生長[33]。而在Margarita 等人的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌標(biāo)本的GCNT3 表達(dá)明顯比正常結(jié)腸組織降低，且GCNT3 低表達(dá)與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)率升高顯著相關(guān)，GCNT3 可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌預(yù)后的標(biāo)志物[28]。在卵巢癌中，GCNT3 的表達(dá)同樣可以削弱卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲特性，還可以提高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性[34]。

2 GCNT3 與胰腺癌

2.1 GCNT3 與胰腺癌的發(fā)生及預(yù)后

為探索GCNT3 在胰腺癌中的表達(dá)情況，Chinthalapally V. Rao等人[14]分別獲取了Kras 基因突變誘導(dǎo)的胰腺癌小鼠模型和野生型小鼠的胰腺組織，通過PCR 擴(kuò)增后分析發(fā)現(xiàn)，與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中GCNT3 的信使RNA（mRNA）表達(dá)量明顯升高。另外對(duì)人類胰腺癌標(biāo)本GCNT3 的免疫組化分析和黏蛋白染色發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管腺癌和胰腺上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本中GCNT3 和黏蛋白表達(dá)均有顯著升高。此外通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，在胰腺癌小鼠中GCNT3 的表達(dá)升高與MUC1、MUC4、MUC6、MUC16等黏蛋白表達(dá)增加顯著相關(guān)，還與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達(dá)升高顯著相關(guān)（P＜0.001）。為進(jìn)一步證實(shí)GCNT3 在胰腺癌中的作用，研究者在通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除胰腺癌細(xì)胞的GCNT3 基因后通過MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)敲除GCNT3 基因后，胰腺癌細(xì)胞活性顯著下降，2 天后細(xì)胞增殖相對(duì)減少達(dá)55%，同時(shí)還表現(xiàn)出細(xì)胞成球能力明顯下降。先前已有研究表明，正常的胰腺組織并不表達(dá)GCNT3[16]，而在小鼠胰腺癌模型和人類胰腺癌組織中均觀察到了GCNT3 的過表達(dá)。以上結(jié)果都提示GCNT3 作為黏蛋白合成過程中的關(guān)鍵酶之一，它的過量表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。

為了進(jìn)一步探索GCNT3 與胰腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，Chinthalapally V. Rao 等人[14]對(duì)90 例胰腺癌標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的正常胰腺組織進(jìn)行了GCNT3 的免疫組化分析，并結(jié)合患者隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GCNT3 高表達(dá)患者相比，GCNT3低表達(dá)的患者總體生存期明顯更長（中位生存期：17.5 月vs10.5月，p=0.036），提示GCNT3 的表達(dá)與胰腺癌患者生存期縮短相關(guān)，GCNT3 可作為預(yù)測(cè)胰腺癌總體生存期的腫瘤標(biāo)記物。此外，在GCNT3 高表達(dá)的患者中發(fā)現(xiàn)多達(dá)62.9%的患者有吸煙飲酒或糖尿病史，提示這些相關(guān)病史可能與促進(jìn)GCNT3 表達(dá)相關(guān)。

2.2 GCNT3 與胰腺癌的治療

由于認(rèn)識(shí)到GCNT3 在黏蛋白合成中的作用，以及它的異常表達(dá)在胰腺癌發(fā)生及進(jìn)展中所起的重要作用，使得GCNT3 有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。得益于GCNT3 的晶體結(jié)構(gòu)已被發(fā)現(xiàn)，Chinthalapally V. Rao 等人[14]通過計(jì)算機(jī)小分子對(duì)接模擬發(fā)現(xiàn)了能與GCNT3 選擇性非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的抑制劑他尼氟酯（talniflumate），對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果表明兩者間可能通過三個(gè)氫鍵結(jié)合。他尼氟酯是一種尼氟酸類藥物，作為一種非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥，可用于輔助治療各種風(fēng)濕性疾病[35]。此外，他尼氟酯作為一種鈣離子激活的氯通道阻滯劑，可以在動(dòng)物模型和細(xì)胞系中抑制黏液的過度分泌，因此在治療呼吸系統(tǒng)疾病方面也具有應(yīng)用前景[36,37]。而在Chinthalapally V. Rao 等人的胰腺癌小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，使用他尼氟酯治療一周后的胰腺癌小鼠在胰腺內(nèi)的黏蛋白和GCNT3表達(dá)量顯著降低，同時(shí)GCNT3 蛋白（P＜0.04）和mRNA（P＜0.03）表達(dá)量均較對(duì)照組明顯降低。以上結(jié)果均表明他尼氟酯可以在小鼠模型中抑制GCNT3 和黏蛋白的表達(dá)。在胰腺癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)他尼氟酯處理后的胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞活力降低，GCNT3 和黏蛋白的表達(dá)也較對(duì)照組顯著降低。而當(dāng)他尼氟酯和EGFR 抑制劑吉非替尼（gefitinib）聯(lián)用時(shí)，對(duì)胰腺癌細(xì)胞GCNT3 和黏蛋白表達(dá)的抑制作用更明顯，提示他尼氟酯不僅自身可能有抑制胰腺癌進(jìn)展的作用，還可增強(qiáng)胰腺癌對(duì)吉非替尼的敏感性，從而可以減少吉非替尼用藥劑量，減輕藥物毒性。截至目前，他尼氟酯在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中通過抑制GCNT3 表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌發(fā)展的效果顯著，但未來若要應(yīng)用于臨床胰腺癌的輔助治療，還需要更多相關(guān)研究的支持。

GCNT3 作為黏蛋白合成復(fù)雜過程中的重要一環(huán)，還可能通過其他途徑抑制其表達(dá)，提高胰腺癌療效。Qian Li 等人[29]通過miRNA 免疫沉淀和雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA 之一miR-302b-3p 的直接作用靶點(diǎn)是GCNT3 基因，miR-302b-3p 與GCNT3 的mRNA 可形成牢固的結(jié)合，他們發(fā)現(xiàn)NSCLC 細(xì)胞內(nèi)miR-302b-3p的表達(dá)與GCNT3 表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，miR-302b-3p 在蛋白質(zhì)水平通過抑制GCNT3 表達(dá)以減弱NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-302b-3p/GCNT3 通路的下游分子包括E-cadherin、N-cadherin、cyclin D1 和p-Erk 等，由此推測(cè)miR-302b-3p/GCNT3 通路可能通過激活ERK 信號(hào)通路和EMT途徑調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞的腫瘤活性，使得miR-302b-3p/GCNT3 通路有望成為NSCLC 治療的新靶點(diǎn)。而目前還沒有miR-302b-3p/GCNT3 通路在胰腺癌中相關(guān)研究，通過促進(jìn)miR-302b-3p 的表達(dá)進(jìn)而抑制GCNT3 有望成為將來改善胰腺癌療效的新靶點(diǎn)。

3 小結(jié)

胰腺癌作為一種高度惡性腫瘤，因早期無明顯的臨床癥狀，而且疾病進(jìn)展迅速，具有極高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能，使胰腺癌成為死亡率極高的惡性腫瘤之一。盡管目前手術(shù)切除聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)輔助化療是胰腺癌的最佳選擇，但療效仍然十分有限。因此，探索胰腺癌診斷及治療的新途徑是十分迫切的任務(wù)。GCNT3 蛋白作為黏蛋白合成過程中的關(guān)鍵酶之一，近年來已有研究發(fā)現(xiàn)抑制GCNT3 表達(dá)可破壞黏蛋白的異常表達(dá)，從而減少胰腺癌對(duì)化療藥物的耐藥性，提高胰腺癌療效。此外，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中也表明GCNT3 的表達(dá)抑制可以減弱胰腺癌細(xì)胞的腫瘤特性，并且證實(shí)了GCNT3 選擇性抑制劑他尼氟酯對(duì)胰腺癌的抑制作用。但GCNT3 在胰腺癌中的具體作用機(jī)制還有待一進(jìn)步的研究闡明，針對(duì)GCNT3 途徑的胰腺癌治療手段還需要更多的探索。我們相信，隨著未來研究的進(jìn)展，GCNT3 在胰腺癌中的作用機(jī)制將會(huì)逐漸揭曉，更多相關(guān)的藥物逐漸會(huì)被發(fā)現(xiàn)、應(yīng)用，GCNT3 在未來有望成為胰腺癌診斷、治療的全新途徑，為改善胰腺癌療效提供更大的支持。