張靖羚，周留林

蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院婦科，江蘇 泰州225400

假基因是與編碼基因序列高度同源的非編碼基因，失去了原有功能的基因拷貝。長期以來，假基因一直被認(rèn)為是“垃圾DNA”，是進化過程中不可避免的結(jié)果[1]。然而，近年來的研究表明，這種對假基因性質(zhì)的理解并不完全正確，許多假基因具有重要的遺傳功能。子宮內(nèi)膜癌是一種發(fā)生于女性子宮內(nèi)膜上皮，嚴(yán)重影響女性身體健康的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，子宮內(nèi)膜癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率正在上升，并且逐漸趨于年輕化[2]。子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于50歲以上的婦女，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌為主，可以分為雌激素依賴型和非雌激素依賴型，前者較為多見[3]。目前主要的治療方法為手術(shù)、放療和藥物（化學(xué)藥物及激素）治療。然而子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚不十分明確，給治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。近些年來許多學(xué)者試圖從分子水平探索其發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移路徑、靶向治療，希望實施精準(zhǔn)的個體化治療方案，因此對于假基因在子宮內(nèi)膜癌中的研究成為熱點。

假基因最初源于對非洲爪蟾基因組的研究。1977年，Jacq等[4]在克隆非洲爪蟾DNA中編碼核糖體大亞基組分之一的5'端，發(fā)現(xiàn)其中存在16 bp的缺失和14 bp的錯配，但沒有檢測出相應(yīng)mRNA分子的截短5S rRNA相關(guān)基因。隨后在包括細(xì)菌、植物、昆蟲和脊椎動物[5-7]在內(nèi)的多種生命形式中都發(fā)現(xiàn)了假基因。根據(jù)最新的HUGO基因命名委員會（Hugo Gene Nomenclature Committee，HGNC）統(tǒng)計[8]，有超過13 000個帶注釋的假基因，隨著基因檢測技術(shù)的進步，這個數(shù)量將不斷增加。由于假基因與其親本基因有高度的同源性，所以它們長期以來一直被認(rèn)為是無功能的，并被認(rèn)為是中性進化的[9]，經(jīng)常被用于校準(zhǔn)分子進化中各種模型的參數(shù)。但是在許多腫瘤疾病中，包括子宮內(nèi)膜癌，假基因可通過調(diào)控相關(guān)基因，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移。本綜述主要討論了基因組中假基因的分類和進化方式、假基因的識別、子宮內(nèi)膜癌相關(guān)假基因及其調(diào)控基因表達的機制。

1 假基因的分類和進化

假基因以兩種方式產(chǎn)生[10]：通過逆轉(zhuǎn)錄以及通過基因組DNA復(fù)制。根據(jù)其原始結(jié)構(gòu)的不同可以分為未加工型假基因和加工型假基因[11]。未加工型假基因包含內(nèi)含子，又可以分為復(fù)制型假基因和單一型假基因。復(fù)制型假基因是在不對等雜交時，重復(fù)基因的反復(fù)拷貝可以使它更快失去原本的功能，單一型假基因是通過單個基因的有害突變產(chǎn)生，所以在基因組中沒有同源基因。加工型假基因沒有內(nèi)含子，主要由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生[12]，會表現(xiàn)出更高的豐度，與單一型假基因相比，它在人類基因組中占更大的比例。Liu等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)加工過的假基因一旦在基因組中出現(xiàn)，就會逐漸向低GC含量、強二核苷酸偏倚、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序減少、形成核小體的能力降低等方面進化。

2 假基因的識別

由于假基因失去了原本親本基因的功能，意味著它可能不再具有編碼能力，但是仍然與其親本基因具有高度相似性，因此有必要制定鑒別假基因的標(biāo)準(zhǔn)，消除在功能基因組學(xué)框架內(nèi)進行的研究中可能出現(xiàn)的假基因。目前大多數(shù)通過假基因的同源序列對原基因的潛在功能進行評估[14]，主要通過比對基因的核苷酸序列、轉(zhuǎn)錄序列或編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列。盡管假基因與基因之間存在顯著的相似性，但假基因通常攜帶多種功能障礙標(biāo)記，如移碼突變、過早終止密碼子、改變翻譯起始位點或剪接位點的突變、缺失啟動子或轉(zhuǎn)錄終止子等。根據(jù)上述標(biāo)記的存在，與某些特定基因同源的DNA序列可被識別為假基因。這種方法的缺點是有些假基因可能缺乏這種明確的標(biāo)記。近年來，Johnson等[15]創(chuàng)建了一個應(yīng)用程序搜索序列同源性、微小RNA（microRNA，miRNA）表達、假基因表達和基因本體的整合功能關(guān)系，用于識別和可視化與癌癥基因組圖譜中的假基因相關(guān)的數(shù)千種潛在調(diào)控關(guān)系。

3 與子宮內(nèi)膜癌有關(guān)的假基因

研究發(fā)現(xiàn)假基因具有以下這幾種功能：①通過過表達降低親本基因mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控親本基因的表達。如常作為子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)志物的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MYLK）基因的假基因MYLKP1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種非編碼RNA，抑制其親本基因MYLK的mRNA表達[16]。②產(chǎn)生小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），通過RNA干涉途徑調(diào)控基因的表達，達到內(nèi)源性siRNA的作用。③反轉(zhuǎn)錄功能：Hawkins和Morris[17]研究發(fā)現(xiàn)若假基因八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4假基因5（octamer binding transcription factor-4 pseudogene 5，OCT4-PG5）的反義被抑制時，OCT4及其假基因OCT4-PG4、OCT4-PG5的表達量則會增加，由此說明與親本基因序列高度同源的假基因可以通過反義轉(zhuǎn)錄調(diào)控其表達。④作為miRNA的誘餌[19]，假基因可以與它們的親本基因競爭與miRNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其同源miRNA對功能基因的抑制。例如，張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）的假基因是一種重要的腫瘤抑制基因，它通過這一機制調(diào)控其親本基因的表達。來自假基因PTENP1的mRNA 3'UTR充當(dāng)了抑制親本基因miRNA的誘餌[18]。⑤編碼短肽或具有功能的蛋白質(zhì)。此外，Han等[19]使用新開發(fā)的計算通道，從癌癥基因組圖譜RNA-seq數(shù)據(jù)中生成了來自7種癌癥類型的2808例患者樣本的假基因表達譜。研究分析顯示，在已建立的腫瘤亞型中有大量的假基因差異表達，僅假基因表達就可以準(zhǔn)確地對子宮內(nèi)膜癌的主要組織學(xué)亞型進行分類。

3.1 假基因PTENP 1與子宮內(nèi)膜癌

PTEN基因是子宮內(nèi)膜癌中最常見的改變基因，也是目前子宮內(nèi)膜癌研究中最常見的抑癌基因。它的突變與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長、增殖、遷移及凋亡有關(guān)。PTENP1和PTEN兩者之間的序列同源性為97.8%，CpG島921 bp區(qū)同源性為91%，是由于PTENP1序列發(fā)生18次錯配，其中的一次錯配引發(fā)了蛋氨酸密碼子的錯義突變，導(dǎo)致起始密碼子消除，所以PTENP1不具有編碼蛋白的能力[20]。PTENP1是腫瘤抑制因子PTEN的假基因。有研究發(fā)現(xiàn)，PTENP1可通過調(diào)節(jié)PTEN的表達在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用[21]。Ioffe等[22]研究發(fā)現(xiàn)PTENP1的轉(zhuǎn)錄水平總體低于PTEN水平，二者表達呈正相關(guān)。PTENP1可能在基因的多個水平對PTEN發(fā)揮調(diào)控作用，進而發(fā)揮腫瘤抑制作用，預(yù)測了miRNA-21、miRNA-19b、miRNA-26a和 miRNA-20a可作為抑制調(diào)控因子。Per等[23]研究發(fā)現(xiàn)PTENP1可轉(zhuǎn)錄形成3個長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），用于調(diào)節(jié)PTEN的轉(zhuǎn)錄和PTENmRNA的穩(wěn)定性，其中包括一個正義RNA（sense RNA，sRNA）和兩個反義RNA（antisense RNA，as-RNA），轉(zhuǎn)錄發(fā)生在兩個相反的重疊啟動子上，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本具有重要的調(diào)控功能，sRNA在細(xì)胞中表現(xiàn)出競爭性的內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）特性。位于假基因sRNA上的miRNA結(jié)合位點（microRNA response element，MRE）與PTENmRNA競爭特異性miRNA，從而阻止了其對PTENmRNA易位的抑制作用。asRNA有兩種亞型，其中β亞型與sRNA的功能類似，通過與RNA之間的配對提高了PTENP1的穩(wěn)定性和miRNA的海綿吸附作用影響PTEN蛋白的生成。相反，α亞型定位于PTEN的啟動子，通過招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNA methyl transferase 3a，DNMT3a）和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）負(fù)向調(diào)控PTEN的轉(zhuǎn)錄。asRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中斷會誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而使細(xì)胞對阿霉素敏感，這說明了PTENP1表達的asRNA具有生物學(xué)功能。

3.2 PTEN和假基因PTENP 1的DNA甲基化與子宮內(nèi)膜癌

Salvesen等[24]研究138例子宮內(nèi)膜癌患者的PTEN甲基化狀態(tài)。其中26例（19%）存在PTEN啟動子甲基化，并發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與腫瘤轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)。由此認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌中普遍存在PTEN甲基化現(xiàn)象，并且PTEN基因的甲基化與子宮內(nèi)膜癌晚期腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，并在腫瘤進展中起重要作用。Ghazanfari等[25]對28例子宮內(nèi)膜癌患者采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對PTEN基因的啟動子甲基化區(qū)域進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN基因啟動子甲基化的頻率在腫瘤組織和血液中分別為28.57%和11.54%。說明DNA甲基化缺陷是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要因素，PTEN啟動子高甲基化可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的危險因素。Kovalenko等[26]研究抑癌基因PTEN最小的啟動子及其假基因PTENP1的5'序列在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜增生中的甲基化狀態(tài)，分析了兩個位點，一個位于PTEN基因的最小啟動子上，另一個在ATG密碼子附近。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTEN基因的DNA未發(fā)生甲基化，但是超過50%的子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜增生組織中PTENP1區(qū)域甲基化，可能是因為沒有考慮到該基因及其假基因PTENP1之間的高度同源性，假基因不能正常表達PTEN的功能，所以不能反映真正的PTEN基因改變。PTENP1基因序列的甲基化可以抑制miRNA參與的PTEN轉(zhuǎn)錄過程。如果假基因序列的甲基化可以抑制其轉(zhuǎn)錄，根據(jù)ceRNA的理論，可能伴隨著RNA干擾機制對PTEN基因表達的抑制。因此，PTENP1異常轉(zhuǎn)錄抑制可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。2018年，Kovalenko等[27]進一步研究PTEN基因及其假基因PTENP1的甲基化模式，選取正常子宮內(nèi)膜組織以及不同年齡階段的子宮內(nèi)膜癌組織和血液樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有被分析的DNA樣本中都沒有攜帶甲基化的PTEN基因。相反，除了外周血外，PTENP1在所有分析組織中均被甲基化，且甲基化率較高，PTENP1甲基化率在年輕女性和中老年女性中存在顯著差異，但是與子宮內(nèi)膜病變沒有直接關(guān)系。

3.3 假基因OCT 4-PG 5與子宮內(nèi)膜癌

轉(zhuǎn)錄因子OCT4[28]是POU家族的成員之一，定位于人類染色體6p21.3，包含5個外顯子，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族中第Ⅴ亞族。POU是DNA結(jié)合蛋白，通過結(jié)合目的基因八聚體基序激活或抑制下游靶基因，進行基因調(diào)控。它是維持胚胎干細(xì)胞自我更新的一個重要調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育過程中參與多向性分化的調(diào)節(jié)[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，OCT4-PG5是子宮內(nèi)膜癌中表達量最高的OCT4假基因，且OCT4-PG5的過度表達增強了細(xì)胞中OCT4-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）-細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）信號通路從而促進子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。此外，miRNA-145模擬物下調(diào)OCT4的表達，而過表達OCT4-PG5可以激活OCT4-PI3K/AKT-cyclin D1信號通路并恢復(fù)OCT4的表達。OCT4-PG5可以作為“miRNA海綿”吸附miRNA-145，減少其對OCT4轉(zhuǎn)錄的抑制作用。

3.4 阿片樣生長因子受體假基因 1與子宮內(nèi)膜癌

Lv等[30]通過研究48例確診的子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織發(fā)現(xiàn)GFRP1在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中均表達上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)其可以通過負(fù)調(diào)控miRNA-124-3p抑制阿片樣生長因子受體假基因1（opiod growth receptor pseudogene 1，OGFRP1）的表達，從而抑制了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞的惡性行為，如抑制細(xì)胞活力、促進細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和侵襲。此外，去乙?；?（sirtuin1，SIRT1）是miRNA-124-3p的靶基因，miRNA-124-3p通過SIRT1的下游信號調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。OGFRP1的失調(diào)可以通過調(diào)節(jié) miRNA-124-3p/SIRT1 軸，激活 PI3K/AKT/糖原合成激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）通路促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。

4 小結(jié)與展望

目前對于假基因在子宮內(nèi)膜癌中的研究還處于早期階段，研究與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的假基因還較少。在這方面，從基因庫中進行全基因組范圍的功能篩選將為假基因表達和功能提供一個全面的視角。對這些假基因特性的研究將有助于更好地理解假基因及其在子宮內(nèi)膜癌中可能存在的作用，為假基因作為子宮內(nèi)膜癌的新生物標(biāo)志物或治療靶點提供新的方向。