王希越,明 明,連麗麗,張 浩,婁大偉

(化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林化工學(xué)院,吉林 吉林 132022)

水稻是世界最主要的糧食作物之一,在我國種植面積廣泛,而且我國有一半以上的人口都是以大米作為主食。大米具有較高的營養(yǎng)價值,其含有豐富的碳水化合物、維生素及少量蛋白質(zhì)、脂肪等[1]。大米中脂肪含量雖然不多,但其是影響大米營養(yǎng)價值及品質(zhì)的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn),脂類氧化造成游離脂肪酸含量增加,進而導(dǎo)致大米陳化、變質(zhì)[2,3]。另外大米中含有人體所必需的幾種脂肪酸,包括亞油酸、亞麻酸、油酸等,這些物質(zhì)不僅是種子的營養(yǎng)物質(zhì),而且具有重要的醫(yī)療價值。研究發(fā)現(xiàn),亞油酸、亞麻酸對防治動脈硬化、糖尿病及心腦血管疾病的發(fā)生具有重要作用[4-6],而且不飽和脂肪酸含量有助于提高大米的香味,改善其整體質(zhì)量[7],因此大米中脂肪酸的分析對其品質(zhì)和營養(yǎng)價值研究有重要作用。

脂肪酸分析一般通過Folch方法、索氏萃取法、蒸餾萃取法等提取后甲酯化衍生,再用氣相色譜-質(zhì)譜進行檢測分析[8-10]。Folch方法中氯仿毒性大,對環(huán)境及人體有較大危害,另外索氏萃取法、蒸餾萃取法也需消耗大量有機溶劑。近年來有研究[11-13]提出原位轉(zhuǎn)酯化方法,可同時實現(xiàn)脂肪酸提取及甲酯化衍生。該方法操作簡單省時,有較好的提取效率及準(zhǔn)確性,且消耗有機溶劑少,不需要使用氯仿等。詹漢英等[13]建立了一步提取衍生方法對貓爪草中的脂肪酸進行分析,以正己烷做提取溶劑,提取衍生8 min,得到脂肪酸總量明顯高于傳統(tǒng)方法。

氣相色譜-質(zhì)譜是目前常用的脂肪酸檢測方法,通過選擇離子監(jiān)測(SIM)的靶向分析方法可提高定量檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性,但是方法的建立需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[14]。2012年,Li等[15]提出保留時間鎖定GC-SIM-MS擬靶向代謝組學(xué)方法,并將其用于不同產(chǎn)地?zé)熑~中代謝物的差異分析。隨后,利用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜(UHPLC-QQQ-MS)的擬靶向代謝組學(xué)方法被發(fā)展起來[16],這類方法兼具有靶向和非靶向分析方法的優(yōu)勢,而且方法建立不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),在疾病、植物等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[17-20]。該實驗基于氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù),通過不同提取方法及提取溶劑的考察優(yōu)化,建立了原位提取衍生-擬靶向方法用于大米中脂肪酸分析,并用其研究5種大米中脂肪酸輪廓差異。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B氣相色譜(美國Agilent公司);M7-300EI質(zhì)譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);XMHS2144水浴恒溫振蕩器(天津歐諾儀器儀表有限公司);XW-80A微型渦旋混合儀(上海瀘西分析儀器有限公司);低速臺式離心機(金壇市科析儀器有限公司);H1650高速臺式離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司);CPA225D精密電子分析天平(德國賽多利斯);N-EVAP 111氮吹儀(美國Organomation Associates公司)。

正己烷(分析純)購自遼寧泉瑞試劑有限公司;丙酮(分析純)購自天津東方化工廠;二氯甲烷(分析純)購自沈陽市華東試劑廠;甲醇(色譜純)購自美國Tedia公司;異丙醇(色譜純)購自沈陽市華東試劑場;三氯甲烷(分析純)購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;氫氧化鉀(分析純)購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。5種水稻(稻花香、吉星、金浪子、農(nóng)大、狀元)采自長春市某鄉(xiāng)鎮(zhèn)稻田。

1.2 實驗方法

1.2.1大米前處理

將5種水稻種子脫殼處理得大米后,用粉碎機粉碎,過60目篩子,于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2提取

分別稱取1 g上述粉碎后的稻花香、吉星、金浪子、農(nóng)大、狀元大米樣品，混合均勻,制成質(zhì)量監(jiān)控(QC)樣品用于方法建立及考察。稱取100 mg QC樣品,置于玻璃管中,加入1 mL正己烷,分別用6種方法進行脂肪酸提取衍生。

恒溫振蕩提取同時衍生:向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)0.25 mL,于30 ℃恒溫水浴振蕩1 h,再加入0.25 mL 2 mol/L鹽酸溶液,渦旋1 min,以3 000 r/min離心10 min,取700 μL上清液,氮氣吹干,用100 μL正己烷溶解后進行GC-MS分析。

搖床振蕩提取同時衍生:向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)后,于30 ℃以200 r/min搖床振蕩提取1 h,其他操作同恒溫振蕩提取同時衍生。

渦旋振蕩提取同時衍生：向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)后,渦旋提取5 min,其他操作同恒溫振蕩提取同時衍生。

恒溫振蕩提取后再衍生:將正己烷溶液于30 ℃恒溫水浴中振蕩1 h,以3 000 r/min離心10 min,取800 μL上清液氮氣吹干,然后加入1 mL正己烷渦旋30 s,再加入0.25 mL甲醇溶液(含2 mol/L KOH),渦旋5 min,再加入0.25 mL 2 mol/L鹽酸溶液,渦旋1 min,混勻。以20 000 r/min離心10 min,取900 μL上清液用氮氣吹干,用100 μL正己烷溶解后進行GC-MS分析。

搖床振蕩提取后再衍生:將正己烷溶液于30 ℃以200 r/min搖床振蕩1 h,以3 000 r/min離心10 min,取800 μL上清液氮氣吹干。脂肪酸甲酯化衍生同恒溫振蕩提取后再衍生。

渦旋振蕩提取后再衍生:將正己烷溶液渦旋提取5 min,以3 000 r/min離心10 min,取800 μL上清液氮氣吹干。脂肪酸甲酯化衍生同恒溫振蕩提取后再衍生。

1.2.3GC-MS條件

色譜柱為安捷倫HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);柱溫箱的起始溫度設(shè)定為150 ℃,然后以20 ℃/min的速率升至214 ℃,再以10 ℃/min的速率升至280 ℃,保持10 min。使用高純氦氣作載氣,其線速度為1.2 mL/min;進樣口溫度設(shè)定為260 ℃;傳輸線溫度設(shè)定為280 ℃;分流比為10∶1;溶劑切割時間為2.0 min。

離子源為電子轟擊源,溫度設(shè)定為230 ℃;全掃描范圍為m/z33～500。選擇離子掃描時間為2.0～5.8 min,掃描離子為m/z69.0、74.0、87.0、242.0、256.0;掃描時間為5.8～6.9 min,掃描離子為m/z67.0、69.0、74.0、294.0、296.0;掃描時間為6.9～12.5 min,掃描離子為m/z69.0、74.0、87.0、324.0、326.0;掃描時間為12.5～19.0 min,掃描離子為m/z74.0、87.0、143.0、368.0、382.0。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

將300 mg QC樣品提取衍生,進樣分析后獲得全掃描數(shù)據(jù)。將儀器采集的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成netCDF格式,導(dǎo)入AMDIS進行去卷積、峰檢測和鑒定。代謝物鑒定主要利用NIST、Mainlib譜庫檢索,并結(jié)合保留指數(shù)加以確認(rèn)。特征離子也通過AMDIS峰檢測獲得。最終得到每個脂肪酸保留時間和特征離子表格用于SIM掃描方法建立。

GC-MS采集數(shù)據(jù)經(jīng)ChemStation進行色譜峰積分,得到包括每種脂肪酸的保留時間和峰面積的二維峰表。數(shù)據(jù)經(jīng)總面積歸一化,導(dǎo)入SIMCA-P 14.0進行主成分分析(PCA);數(shù)據(jù)經(jīng)UV歸一化后,用MeV4.9.0進行熱圖分析;折線圖用Origin 9.0軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

QC樣品經(jīng)6種提取方法提取分析,分別得到的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的總響應(yīng)強度(見圖1)?？梢悦黠@看出,不論飽和脂肪酸還是不飽和脂肪酸,采用恒溫振蕩提取同時衍生方法得到的總強度都是最高的。因此選取恒溫振蕩提取同時衍生方法用于處理后續(xù)樣品。

圖1 不同提取方法對飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸響應(yīng)的影響(n=3)Fig.1 Effect of different extraction methods on the intensities of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids (n=3) 1.derivation and extraction simultaneous by isothermal oscillation;2.derivation and extraction simultaneous by shaker oscillation;3.derivation and extraction simultaneous by vortex oscillation;4.derivation following extraction by isothermal oscillation;5.derivation following extraction by shaker oscillation;6.derivation following extraction by vortex oscillation.

2.2 提取溶劑的選擇

本實驗稱取100 mg QC樣品,分別加入4種提取溶劑(正己烷、正己烷-丙酮(4∶1,v/v)、正己烷-二氯甲烷(4∶1,v/v)和正己烷-異丙醇(3∶2,v/v)),利用恒溫振蕩提取同時衍生方法提取脂肪酸,考察不同提取溶劑對脂肪酸提取效率的影響。結(jié)果如圖2所示,采用正己烷提取時,飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的相應(yīng)強度均最大。因此后續(xù)實驗采用正己烷作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸響應(yīng)強度的影響(n=5)Fig.2 Effect of the different extraction solvents on the intensities of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids (n=5)

2.3 擬靶向分析方法建立

為避免丟失低豐度物質(zhì)信息,實驗使用300 mg QC樣品建立擬靶向分析方法,得到典型離子流色譜圖(見圖3)。該方法共檢測到16種脂肪酸,分別為C14∶0、C15∶0、C16∶1、C16∶0、C17∶1、C17∶0、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶1、C20∶0、C22∶1、C22∶0、C23∶0、C24∶0和C26∶0。

圖3 QC樣品中16種脂肪酸的總離子流色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of the 16 fatty acids in the quanlity control (QC)sample

圖4為C26∶0、C17∶1、C17∶0 3種脂肪酸在全掃描模式(full scan)和SIM模式下的色譜圖?；赟IM掃描的擬靶向分析方法比傳統(tǒng)的非靶向分析方法具有更好的靈敏度,可用于大米中脂肪酸的準(zhǔn)確定量分析。

圖4 C26∶0、C17∶1、C17∶0在選擇離子掃描模式和全掃描模式下的色譜圖Fig.4 Chromatograms of C26∶0,C17∶1,C17∶0 in SIM and full scan modes

2.4 重復(fù)性考察

選取正己烷作為提取溶劑,用恒溫振蕩提取同時衍生方法對QC樣品中的脂肪酸進行提取,平行處理8份樣品,以每種脂肪酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的穩(wěn)定性,16種脂肪酸相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,由此說明該方法穩(wěn)定性較好。

2.5 方法應(yīng)用

基于所建立的方法對稻花香、吉星、金浪子、農(nóng)大、狀元5種大米中的脂肪酸進行提取,采集譜圖信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理后,得到脂肪酸二維峰表,總面積歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P,UV標(biāo)尺化后進行PCA模型識別分析。圖5顯示了5種大米樣品的PCA得分圖,其中，R2X=0.867,Q2=0.8,R2X代表PCA模型中主成分解釋變量占總變量的百分比,Q2代表根據(jù)交叉驗證PCA模型預(yù)測的訓(xùn)練集中變量百分比,說明該模型有較好的解釋和預(yù)測能力。從圖中可以看出，稻花香大米與其他4種在主成分2(t[2])上區(qū)分明顯,說明彼此之間脂肪酸輪廓差異較大;而金浪子、吉星、狀元和農(nóng)大在主成分1(t[1])上有明顯區(qū)分,尤其是金浪子和農(nóng)大間差異較大,說明金浪子中脂肪酸輪廓與農(nóng)大中有較大不同。

圖5 5種大米樣品的主成分分析得分圖Fig.5 Principal component analysis (PCA)score plot of the five rice samples

為了更明顯地看出5種大米中脂肪酸輪廓差異,16種脂肪酸熱圖見圖6。從圖6可以清晰地看到,稻花香大米中脂肪酸輪廓明顯不同于其他4種,金浪子和農(nóng)大、狀元間脂肪酸輪廓差異也較大,除C22∶1,大部分脂肪酸在金浪子中含量均較少,而農(nóng)大和狀元中大部分脂肪酸含量均高于其他3種。

圖6 5種大米樣品中脂肪酸的熱圖Fig.6 Heat map of the fatty acids in the five rice samples

3 結(jié)論

本實驗基于GC-MS平臺建立了擬靶向代謝組學(xué)分析方法研究大米中脂肪酸輪廓。該方法不需要購買標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),相對于經(jīng)典的全掃描模式下非靶向代謝組學(xué)方法,有較好的靈敏度,可實現(xiàn)樣品中低豐度物質(zhì)的準(zhǔn)確定量分析。將該方法用于5種大米樣品中脂肪酸分析,可準(zhǔn)確獲得各樣品間脂肪酸輪廓差異信息,可為今后研究脂肪酸對大米營養(yǎng)價值及品質(zhì)改善的影響奠定基礎(chǔ)。