陳克云,李 玲,鞠 香,王艷麗,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101)

近年來互聯(lián)網(wǎng)上流傳的沸沸揚揚的“蒜苔沾毒藥水”事件涉及蒜苔收獲后、入庫貯藏前的處理,用來蘸蒜苔的乳白色液體是一種蒜苔保鮮劑乳液,其主要成分是咪鮮胺等保鮮劑。咪鮮胺是一種廣譜、高效、低毒型的咪唑類殺菌劑,常用于水果、蔬菜和蘑菇的采后處理[1-4]。

咪鮮胺可有效抑制蒜苔貯藏期霉變、老化,結(jié)合冷庫貯藏可使蒜苔貯藏期延長至8個月以上,是國家允許在食品加工領(lǐng)域使用的保鮮劑。我國農(nóng)藥最大殘留限量標準[5]規(guī)定了咪鮮胺在大蒜中最高殘留限量為0.1 mg/kg、在黃瓜中最高殘留限量為1 mg/kg,在菜苔、辣椒中最高殘留限量為2 mg/kg,但尚未制定蒜苔中咪鮮胺殘留量的限量要求。

有研究表明咪鮮胺是一種新的內(nèi)分泌干擾物,它能引發(fā)雙重作用機制[6,7],而且咪鮮胺在植物體內(nèi)會發(fā)生特異性轉(zhuǎn)化[8],其代謝途徑見圖1。咪鮮胺轉(zhuǎn)化為初級代謝物BTS44595和BTS44596的過程表現(xiàn)為明顯的解毒作用,而初級代謝物BTS44595和BTS44596代謝轉(zhuǎn)化為次級代謝物BTS45186(2,4,6-三氯苯酚)的過程則表現(xiàn)為極顯著的增毒作用[9]。有報道稱2,4,6-三氯苯酚可對人類神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響,如慢性支氣管炎、咳嗽和肺功能改變[10,11],2,4,6-三氯苯酚還具有較高的毒性、致癌性和致突變能力,它結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在環(huán)境中持久存在[12]。因此在評價咪鮮胺的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)和毒性時,不僅應(yīng)考慮咪鮮胺母體的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)和生物毒性,還應(yīng)特別重視咪鮮胺代謝物2,4,6-三氯苯酚的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)與生物毒性。

目前國內(nèi)外對咪鮮胺及其主要代謝物的殘留分析方法主要有3種:一種只能分析以游離形式存在的咪鮮胺母體的殘留量[13];一種只測定咪鮮胺和毒性較大的代謝物2,4,6-三氯苯酚的殘留量[14-16];還有一種利用吡啶鹽酸鹽水解法分析咪鮮胺及其主要代謝物(分子中含有2,4,6-三氯苯氧基的化合物)的總量[17]。常見的檢測咪鮮胺的方法有氣相色譜法[14,17]、液相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、液相色譜-質(zhì)譜法[15]。上述方法存在前處理復雜或未能測定咪鮮胺總量或重要代謝產(chǎn)物殘留量等缺點。

本文采用氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測,建立了蒜苔中咪鮮胺及其代謝物殘留檢測的兩種方法:QuEChERS方法和水解法。并比較了QuEChERS方法和水解法在測定蒜苔中咪鮮胺及其代謝物殘留量方面的差異,旨在為國家制定蒜苔中咪鮮胺風險監(jiān)測和風險評估提供技術(shù)支持。

圖1 咪鮮胺在植物體內(nèi)的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of prochloraz in plants

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜儀配電子捕獲檢測器(ECD)(Agilent7890B,美國安捷倫公司);氮吹儀(美國Organomation公司);高速離心機(德國Sigma公司);Milli-Q超純水機(美國Millipore公司);電子分析天平(北京賽多利斯公司)。

乙腈和正己烷(農(nóng)殘級,德國默克公司);吡啶鹽酸鹽(分析純,北京百靈威科技有限公司);石油醚、NaCl、鹽酸(均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司);咪鮮胺標準物質(zhì)(1 g/L,北京曼哈格公司);2,4,6-三氯苯酚標準物質(zhì)(1 g/L,德國DR公司)。蒜苔為市售。

1.2 前處理方法

1.2.1QuEChERS法

稱取10.00 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,渦旋混勻,超聲15 min,加入6 g氯化鈉,渦旋混勻后離心,取上清液,用含900 mg MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(N-丙基乙二胺)和50 mg GCB(石墨化碳黑)的QuEChERS凈化管凈化,離心后取10mL上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,氮吹至近干,用1 mL正己烷定容。取200 μL溶液上機檢測,用于測定咪鮮胺。剩余溶液加200 μL硫酸后搖勻,靜置2 h后上機檢測,用于測定2,4,6-三氯苯酚。

1.2.2水解法

稱取10.00 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,渦旋混勻,超聲15 min,加入6 g氯化鈉,渦旋混勻后離心,取10 mL上清液轉(zhuǎn)移至25 mL玻璃比色管中,氮吹至近干。比色管中加入2.5 g吡啶鹽酸鹽,在220 ℃的烘箱中水解1 h,冷卻后用15 mL水分3次清洗比色管,將其轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,用25 mL石油醚萃取2次,合并有機相。將有機相氮吹至約15 mL,加入1 mL硫酸磺化,靜置分層,棄去硫酸。然后用25 mL超純水洗滌至中性,收集有機相于15 mL離心管中,氮吹濃縮至近干,用1 mL正己烷定容,上機檢測。

1.3 儀器條件

色譜柱為DB-17(30 m×320 μm×0.25 μm,美國Agilent公司);進樣口溫度:270 ℃;檢測器(ECD)溫度:300 ℃。升溫程序:初始溫度為70 ℃,保持1 min,以30 ℃/min的速率升至250 ℃,保持8 min。進樣方式:不分流進樣;進樣量:1 μL;載氣:高純氮氣(純度為99.999%);恒定流速:2.5 mL/min。2,4,6-三氯苯酚保留時間為5.189 min,咪鮮胺的保留時間為12.388 min。咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的標準溶液色譜圖見圖2。

圖2 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的標準溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol standard solution

1.4 理論計算方法

1.4.1QuEChERS法計算方法

咪鮮胺的總殘留量通過將代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為母體來計算。咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的相對分子質(zhì)量分別為376和197,兩個化合物相對分子質(zhì)量的比值保留3位有效數(shù)字即為咪鮮胺與2,4,6-三氯苯酚的轉(zhuǎn)化系數(shù)[18],計算咪鮮胺總殘留量的公式如下:

C=C1+1.91×C2

(1)

C代表咪鮮胺的總殘留量(單位為mg/kg);C1代表試樣中咪鮮胺的殘留量(單位為mg/kg);C2代表試樣中2,4,6-三氯苯酚的殘留量(單位為mg/kg);1.91為咪鮮胺轉(zhuǎn)與2,4,6-三氯苯酚的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.4.2水解法計算方法

因咪鮮胺標準工作溶液同樣品一起水解,因此直接采用咪鮮胺標準溶液水解標準曲線定量的方式進行計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS法前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的優(yōu)化

在蒜苔基質(zhì)中進行添加回收率測定試驗,分別選用乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取溶劑,QuEChERS凈化后用氣相色譜測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丙酮、乙酸乙酯作為溶劑提取后回收率較好,但色素較多,經(jīng)QuEChERS凈化管凈化后顏色仍很重;二氯甲烷提取回收率低,通過綜合考察4種溶劑的提取效率及提取液的干凈程度,最終選擇極性大、毒性小、穿透力強、提取效率高的乙腈作為提取劑。

2.1.2凈化條件的選擇

在空白蒜苔基質(zhì)中添加0.2 mg/kg咪鮮胺,考察了含不同GCB量的QuEChERS凈化管對凈化效率的影響。結(jié)果(見圖3)表明,在凈化過程中,GCB的用量對蒜苔咪鮮胺的回收率有明顯影響,隨著GCB含量的增加,蒜苔中咪鮮胺的回收率逐漸降低。推測可能是GCB優(yōu)先吸附基質(zhì)中存在的色素等干擾物,隨著其含量的增加,則會對目標物有一定的吸附。不含GCB和含有50 mg GCB的QuEChERS凈化管均可獲得最佳的回收率,考慮到色譜柱、儀器耗材使用壽命的因素,本著最大程度消除基質(zhì)干擾和最低程度吸附目標物的原則,最終選擇用含900 mg MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和50 mg GCB的凈化管凈化。試驗發(fā)現(xiàn),2,4,6-三氯苯酚出峰位置基質(zhì)干擾較大,因此進一步采用加硫酸磺化的方式處理。

圖3 不同GCB含量凈化管對咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚回收率的影響Fig.3 Effects of different graphitized carbon blacks (GCB)amounts on the recoveries of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

2.1.3定量方式的考察

考察了溶劑標準曲線與基質(zhì)標準曲線在定量方面的差異。用正己烷作溶劑配制的系列工作溶液濃度與在儀器上的響應(yīng)繪制的曲線做溶劑標準曲線;用空白樣品經(jīng)QuEChERS法前處理后的定容溶液配制的系列工作溶液濃度與在儀器上的響應(yīng)繪制的曲線做基質(zhì)標準曲線。結(jié)果表明,QuEChERS法測定咪鮮胺存在基質(zhì)效應(yīng),其值為155%,因此應(yīng)采用基質(zhì)匹配標準曲線來定量。基質(zhì)效應(yīng)采用基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線斜率的比值來計算。

2.2 水解法前處理條件的優(yōu)化

2.2.1水解過程的優(yōu)化

標準NY/T 1456-2008中,水解過程采用的是將圓底燒瓶與冷凝管連接,并置于210～240 ℃沙浴中水解。本文利用比色管代替圓底燒瓶、烘箱替代沙浴,棄去了冷凝裝置,簡化了加熱反應(yīng),建立了一套高通量、快速、安全便捷且靈敏度高的方法,提高了檢測樣品的效率,減少了試劑用量,節(jié)省了成本。

2.2.2咪鮮胺水解轉(zhuǎn)化效率的考察

咪鮮胺是否完全轉(zhuǎn)化為2,4,6-三氯苯酚將直接影響到水解方法的可靠性和準確度,因此本文進行了咪鮮胺水解轉(zhuǎn)化率的試驗。添加6份1 mg/L的咪鮮胺標準溶液于比色管中,按1.2.2節(jié)方法進行處理,用2,4,6-三氯苯酚標準曲線定量,結(jié)果表明,平均水解轉(zhuǎn)化率為101.2%,說明咪鮮胺得到了完全的轉(zhuǎn)化,證明該方法是可行的。

2.2.3定量方式的考察

水解法標準曲線考察了3種方式:2,4,6-三氯苯酚的溶劑標準曲線、咪鮮胺標準溶液水解標準曲線和基質(zhì)匹配添加咪鮮胺標準溶液后水解標準曲線。結(jié)果表明,3種方式定量均無差異,水解法不存在基質(zhì)效應(yīng)。日常檢驗參照NY/T1456-2008使用咪鮮胺標準溶液水解標準曲線定量的方式。

2.3 儀器條件的優(yōu)化

標準NY/T 1456-2008中進樣口溫度為240 ℃,在此儀器條件下,2,4,6-三氯苯酚響應(yīng)較好,而咪鮮胺響應(yīng)較低。試驗發(fā)現(xiàn),進樣口溫度的設(shè)定對咪鮮胺的峰形和檢測靈敏度有顯著影響,對2,4,6-三氯苯酚影響不大。進樣口溫度過低,待測物不能有效地汽化,容易導致待測物被吸附在進樣口;而進樣口溫度過高,容易導致咪鮮胺發(fā)生高溫分解。升高進樣口溫度有助于提高靈敏度,在合理的范圍內(nèi)(溫度為250～300 ℃)選擇的汽化溫度越高,高沸點物質(zhì)的揮發(fā)程度越大,會進入色譜柱造成污染,而且進樣口溫度過高對色譜柱有一定損害,因此在能滿足汽化需要的前提下,盡量選擇較低溫度,使高沸點物質(zhì)盡可能地保留在進樣口玻璃襯管中,最終選擇270 ℃為最佳進樣口溫度。不同進樣口溫度對咪鮮胺峰面積的影響見圖4。

圖4 不同進樣口溫度對咪鮮胺響應(yīng)的影響Fig.4 Effects of different injection temperatures on the response of prochloraz

2.4 方法學考察

2.4.1線性范圍、檢出限及定量限

水解法咪鮮胺標準工作液的制備:移取1 mL咪鮮胺標準物質(zhì),用丙酮定容至100 mL,配制成10 mg/L的標準儲備液,再移取不同體積的咪鮮胺標準儲備液,按照1.2.2節(jié)方法水解凈化后,配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L咪鮮胺標準工作溶液。按1.3節(jié)的條件測定,以咪鮮胺峰面積(y1)為縱坐標,以其質(zhì)量濃度(x1,mg/L)為橫坐標繪制標準曲線,得到咪鮮胺的線性方程及相關(guān)系數(shù)r2。

表1 咪鮮胺及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear equations,r2,LODs,and LOQs for prochloraz and its metabolites

y1:response of prochloraz using hydrolysis method;y2:response of prochloraz using QuEChERS method;y3:response of 2,4,6-trichlorophenol using QuEChERS method;x1:mass concentration (mg/L)of prochloraz using hydrolysis method;x2:mass concentration (mg/L)of prochloraz using QuEChERS method;x3:mass concentration (mg/L)of 2,4,6-trichlorophenol using QuEChERS method.

表2 咪鮮胺及其代謝物的平均添加回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and RSDs of prochloraz and its metabolites (n=6)

QuEChERS法中咪鮮胺及其代謝物標準工作液的制備:用不含咪鮮胺及其代謝物的空白樣品提取液來配制咪鮮胺及其代謝物標準溶液。按1.3節(jié)的條件測定,分別以咪鮮胺及其代謝物的峰面積(y2、y3)為縱坐標,以其質(zhì)量濃度0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L為橫坐標(x2、x3,mg/L)繪制標準曲線,得到咪鮮胺及其代謝物的線性方程及相關(guān)系數(shù)r2。在優(yōu)化的前處理條件下,通過空白樣品加標試驗確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),具體見表1。

2.4.2精密度和回收率

稱取不含目標物的蒜苔,分別添加3個水平的咪鮮胺及其2,4,6-三氯苯酚的混合標準溶液,按所建立的方法進行測定。每份樣品進行6次平行測定,考察方法的回收率和精密度。由表2可知,兩種方法的回收率為81.5%～105.4%,相對標準偏差(RSD)為1.3%～6.8%,該方法具有較好的可靠性。

2.5 水解法與QuEChERS法在測定陽性樣品方面的差異

利用水解法及QuEChERS法對10份陽性蒜苔樣品中咪鮮胺及其代謝物殘留進行檢測分析,測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明,QuEChERS法測定值低于水解法,推測其原因可能是QuEChERS法前處理只分析了以游離形式存在的咪鮮胺母體及2,4,6-三氯苯酚,而對咪鮮胺在植物體內(nèi)形成的其他代謝產(chǎn)物及其軛合殘留物未做檢測;吡啶鹽酸鹽水解法可以將以游離形式及軛合形式存在的咪鮮胺母體及其代謝物全部轉(zhuǎn)化為2,4,6-三氯苯酚來測定,更加全面地檢測出樣品中咪鮮胺及其代謝物的總量,但無法測得咪鮮胺及其主要代謝物的存在形式和各自的含量。目前,其他3種中間代謝物的毒性未見報道,而關(guān)注較多、毒性較大的代謝產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚的含量則具有重要的指示意義。

表3 蒜苔中咪鮮胺的分析結(jié)果Table 3 Analytical results for prochloraz in garlic bolting

3 結(jié)論

本文建立了水解法、QuEChERS法兩種方法測定蒜苔中咪鮮胺及其代謝物的殘留量,并對這兩種方法的差異進行了比較。結(jié)果表明,兩種方法準確度和精密度高,且具有較高的靈敏度,均符合方法學驗證要求。在測定陽性樣品時,水解法可以測定以游離形式及軛合形式存在的咪鮮胺母體及其代謝物的總和,但不清楚其各自的存在形式及含量。QuEChERS法可以準確測定咪鮮胺及其重要代謝產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚的存在形式及含量,但無法測定咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物的總量。兩種方法相輔相成,為國家風險監(jiān)測、風險評估提供技術(shù)支持,為制定蒜苔中咪鮮胺的最大殘留限量、控制風險奠定了基礎(chǔ),更好地服務(wù)監(jiān)管。