肖 泳,吳海智,袁列江,唐吉旺,王淑霞,王 秀,鄧 航,吳 林

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 長沙 410007)

矮壯素(chlormequat chloride,CCC,分子結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種季銨鹽類植物生長調(diào)節(jié)劑,可用于小麥、水稻、棉花、煙草、玉米及西紅柿等作物,能明顯改善農(nóng)作物品質(zhì),提高產(chǎn)量。然而,矮壯素可引起人和動物急性中毒,并對動物的繁殖能力有不良影響,美國國家職業(yè)安全和健康研究所(NIOSH)已將矮壯素列為疑似內(nèi)分泌干擾物質(zhì)。因此,食品中矮壯素的殘留已成為影響食品安全的重要潛在因素,許多國家和地區(qū)對這類農(nóng)藥在食品中的殘留量制定了嚴格的限量標準。國際食品法典委員會(CAC)制定了包括谷物及其加工制品、油料以及動物產(chǎn)品中矮壯素的限量標準;歐盟制定了包括谷物及其加工制品、油料、動物產(chǎn)品、蔬菜、水果、茶葉、調(diào)味品等10類產(chǎn)品中矮壯素的限量標準;日本制定了谷物及其加工制品、油料、動物產(chǎn)品、蔬菜、水果等9類產(chǎn)品中矮壯素的限量標準。2018年,美國環(huán)保署不同基質(zhì)中對矮壯素最大殘留限量進行了修訂,包含大麥、燕麥、小麥、豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、豬肉副產(chǎn)品、牛肉副產(chǎn)品、山羊肉副產(chǎn)品、綿羊肉副產(chǎn)品、牛奶、禽肉、禽肉副產(chǎn)品、蛋;新版國家標準GB 2763-2019中對谷物、油料和油脂、蔬菜中矮壯素最大殘留限量作了規(guī)定,且新增了哺乳動物肉類及內(nèi)臟(海洋哺乳動物除外)、禽肉類、禽類內(nèi)臟、蛋類、生乳的臨時限量,但該標準中只有谷物、油料和油脂、蔬菜的測定方法。

圖1 矮壯素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure formula of chlormequat chloride (CCC)

目前,國內(nèi)外關(guān)于食品中矮壯素的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2-17]和離子色譜法[18]等。離子色譜法靈敏度沒有氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法高,氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理相對簡便且具有高特異性和高靈敏度。矮壯素常用的前處理方法有直接萃取法[3,6,7]、QuEChERS法[4,5,17]、固相萃取法(SPE)[11-16]等,常用的固相萃取柱有陽離子交換柱[13,14]、弱陽離子交換柱[11,12]、HLB固相萃取小柱[15,16]等,但現(xiàn)有文獻方法大多針對蔬菜、水果、糧谷類樣品,對動物源性食品中矮壯素檢測的研究很少。本文以動物源性食品為研究對象,采用內(nèi)標法定量,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源性食品中矮壯素殘留的分析方法,并研究了色譜柱、提取溶劑、凈化方式、固相萃取柱等因素對矮壯素提取效率及凈化效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Ultra-AM高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo公司);MV5多通道氮吹濃縮儀(萊伯泰科有限公司);DHS-220雙模式自動均質(zhì)儀(北京萊伯泰科有限公司);Allegra 64R高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司);GM200刀式研磨儀(德國Retsch公司);Venusil MP C18(2)色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)、Agela Cleanert PCX固相萃取柱(60 mg/3 mL)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

矮壯素(純度99.0%)、矮壯素-D4(純度99.3%)(德國Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、正己烷、甲醇、甲酸、乙酸(HPLC級,上海安譜公司);乙酸銨(HPLC級,美國ROE公司);ODS C18粉末(50 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司);無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、氯化鈉(分析純,國藥集團有限公司)。

稱取適量矮壯素和矮壯素-D4標準品,分別用甲醇配制成1.00 g/L的標準儲備液,于0～4 ℃冰箱中儲存。根據(jù)需要將矮壯素標準儲備液用乙腈稀釋成適當濃度的標準工作液,將矮壯素-D4內(nèi)標儲備液用乙腈稀釋成1.00 mg/L的內(nèi)標工作液,于0～4 ℃冷藏儲存,備用。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品制備

豬、牛、羊、雞等畜禽類樣品取可食肌肉組織、內(nèi)臟、蹄翅(去骨)約200 g,切碎后經(jīng)刀式研磨儀充分攪碎混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,于-18 ℃以下冷凍保存。蛋類取10枚,去殼后經(jīng)刀式研磨儀充分混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封;牛奶樣品取約200 g充分混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,蛋類和牛奶樣品置于0～4 ℃冷藏保存。

1.2.2樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)制備均勻的樣品,置于50 mL具塞離心管中,準確加入50 μL CCC-D4內(nèi)標溶液(1.00 mg/L),混勻靜置20 min;加入15 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,均質(zhì)2 min后超聲5 min,加入1～2 g氯化鈉、2～3 g無水硫酸鎂,均質(zhì)2 min,用10 mL乙腈清洗均質(zhì)頭和超聲棒體,清洗液并入樣品離心管中,離心,收集提取液;殘渣加入15 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,均質(zhì)提取2 min,并用10 mL乙腈清洗均質(zhì)頭,清洗液并入樣品離心管中,離心,合并兩次提取液并用乙腈定容至50 mL;取15 mL提取液,用10 mL乙腈飽和的正己烷脫脂兩次,準確移取10 mL提取液,于40 ℃氮吹濃縮至干,加入3 mL水溶解樣品,待進一步凈化。

用3 mL甲醇和3 mL水活化PCX固相萃取柱,上樣,用3 mL水和3 mL甲醇淋洗除雜,用5 mL甲醇(含100 mmol/L乙酸銨)溶液洗脫;洗脫液于40 ℃氮吹濃縮至干,用1 mL乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(1∶1,v/v)溶解殘渣,過0.22 μm有機濾膜后,供HPLC-MS/MS測定。

1.2.3色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Venusil MP C18(2)柱(150 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.00 min,10%B;1.00～3.50 min,10%B～95%B;3.50～4.00 min,95%B;4.00～4.01 min,95%B～10%B;4.01～5.00 min,10%B。進樣體積:10 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描模式:正離子掃描;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細管溫度:350 ℃;蒸發(fā)溫度:300 ℃;鞘氣流量:9.45 L/min;輔助氣流量:12.1 L/min;噴霧電壓:3 500 V;其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 CCC和CCC-D4的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of CCC and CCC-D4

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱的選擇

矮壯素常采用的色譜柱有C18柱[3,7,14,15,17]、HILIC柱[6,8,10-12]等,本方法以加標雞蛋樣品為研究對象,在流動相均采用0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸銨)和乙腈的條件下，比較了Venusil MP C18(2)(150 mm×2.1 mm,3 μm)、Venusil HILIC(150 mm×2.1 mm,3 μm)、Thermo Hypersil Gold(150 mm×2.1 mm,3 μm)3種色譜柱對矮壯素的保留能力和出峰效果(見圖2)。Venusil HILIC柱分離時,采用0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸銨)-乙腈(40∶60,v/v)等度洗脫;采用Venusil MP C18(2)柱和Thermo Hypersil Gold柱分離時,采用1.2.3節(jié)的梯度洗脫程序。結(jié)果表明,3種色譜柱的出峰時間差別不大,但是采用Venusil MP C18(2)色譜柱時,矮壯素的峰形比采用另外兩種色譜柱時更好、更對稱。因此,選擇Venusil MP C18(2)色譜柱作為矮壯素的分離色譜柱。

圖2 采用不同色譜柱時加標雞蛋樣品中矮壯素(0.500 μg/kg)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of CCC (0.500 μg/kg)spiked in egg samples using the different chromatographic columns a.column:Venusil MP C18(2)(150 mm×2.1 mm,3μm);mobile phase:(A)0.1% (v/v)formic acid aqueous solution (containing 10 mmol/L ammonium acetate)and (B)acetonitrile;gradient elution program:0-1.00 min,10%B;1.00-3.50 min,10%B-95%B;3.50-4.00 min,95%B;4.00-4.01 min,95%B-10%B;4.01-5.00 min,10%B.b.column:Venusil HILIC (150 mm×2.1 mm,3μm);mobile phase:0.1% (v/v)formic acid aqueous solution (containing 10 mmol/L ammonium acetate)-acetonitrile (40∶60,v/v);isocratic elution.c.column:Thermo Hypersil Gold (150 mm×2.1 mm,3 μm).Mobile phases and gradient elution program were the same as that in Fig.2a.

2.1.2流動相的選擇

實驗分別考察了流動相為水-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液(10 mmol/L乙酸銨溶液)-乙腈時矮壯素的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn),含有0.1%(v/v)甲酸水溶液的流動相能有效提高矮壯素的離子化效率,增強檢測靈敏度,而乙酸銨的加入對樣品中矮壯素的分離并沒有明顯的影響。因此,實驗選擇0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

2.2 提取溶劑的選擇

矮壯素具有強極性,易溶于水、甲醇和乙腈等溶劑,常采用甲醇-水、甲醇-水-乙酸溶液、乙腈等溶劑進行提取。李春梅等[12]比較了純水和不同體積分數(shù)的甲醇水溶液、乙腈水溶液對矮壯素回收率的影響,最終得出用乙腈作為小鼠肌肉中矮壯素的提取溶劑效果最佳。考慮到動物源性食品中蛋白質(zhì)含量均較高,本研究用含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液作為提取溶劑,以進一步沉淀樣品中的蛋白質(zhì);考慮到動物源性食品中脂肪含量均較高,用正己烷對提取液進行脫脂處理后,發(fā)現(xiàn)提取液明顯變得澄清,且不會影響矮壯素的回收率。因此,實驗選擇含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液作為提取溶劑,并用正己烷對提取液進行脫脂處理。

2.3 凈化方式的選擇

矮壯素常用的前處理方法有直接萃取法、QuEChERS法和SPE法等。實驗嘗試采用含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液提取、濃縮后直接過膜上機測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于動物源性樣品中脂肪和蛋白質(zhì)含量較高,提取液濃縮復(fù)溶后不利于過膜,且基質(zhì)抑制作用明顯,雜質(zhì)峰干擾大,不利于定量;采用含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液提取,并加入QuEChERS鹽包(含無水硫酸鎂、無水乙酸鈉),提取液再經(jīng)QuEChERS凈化管(含C18粉末和無水硫酸鎂)凈化,濃縮后過膜上機測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方法對動物源性樣品的凈化效果不是特別理想,目標峰尾部有小的干擾峰,方法靈敏度較SPE法低,QuEChERS法采用內(nèi)標法定量時,方法回收率能達到80.0%以上,可適用于大批量樣品的篩查;采用SPE法能有效去除樣品中的雜質(zhì),方法靈敏度高，回收率好。因此,實驗選擇SPE法作為前處理方法。

矮壯素常用的固相萃取柱有陽離子交換柱、弱陽離子交換柱、HLB固相萃取小柱等。本研究比較了Supelclean LC-WCX固相萃取柱(500 mg/3 mL)、CNW Poly-Sery HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)、Agela Cleanert PCX固相萃取柱(60 mg/3 mL)的凈化效果和回收率。采用WCX柱作為凈化柱時,矮壯素的回收率為85.2%,與李春梅等[12]的研究結(jié)果一致。本方法按內(nèi)標法計算時,回收率接近100%,但是該柱在凈化肝腎樣品時,色譜峰尾部有小的干擾峰。楊濤等[16]選擇HLB柱作為凈化柱,用5%(v/v)甲醇水溶液淋洗和甲醇洗脫后方法的回收率為82.5%～104%,而本研究發(fā)現(xiàn)，用5%(v/v)甲醇水溶液淋洗時矮壯素和內(nèi)標均有不同程度的損失,最終回收率不到40.0%,這與楊濤等[16]的研究結(jié)果不一致;本研究采用曹慧等[15]的方法對動物源性食品進行凈化，選擇HLB柱作為凈化柱,并未淋洗而是直接用5%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫,發(fā)現(xiàn)目標峰尾部有干擾峰,不利于定量。李娜等[14]選擇PCX柱作為凈化柱,用水、50%(v/v)甲醇水溶液、甲醇淋洗,50%(v/v)甲醇水溶液(100 mmol/L乙酸銨)洗脫,方法的回收率為90.5%～98.5%,本研究發(fā)現(xiàn)對于動物源性食品采用李娜等[14]的凈化方法能有效去除樣品中的雜質(zhì),方法回收率可達90%以上。因此,實驗最終選擇PCX固相萃取小柱進行凈化。

圖3 不同洗脫溶液對矮壯素回收率的影響Fig.3 Effects of different elution solutions on the recoveries of CCC A.methanol (containing 50 mmol/L ammonium acetate);B.methanol (containing 75 mmol/L ammonium acetate);C.methanol (containing 100 mmol/L ammonium acetate);D.50% (v/v)methanol aqueous solution (containing 100 mmol/L ammonium acetate);E.80% (v/v)methanol aqueous solution (containing 100 mmol/L ammonium acetate).

矮壯素在PCX小柱中保留能力較強,用甲醇無法直接洗脫下來,需加入一定量的乙酸銨。研究采用PCX柱作為凈化柱,以水、甲醇為淋洗液,以含不同濃度乙酸銨的甲醇溶液為洗脫溶液進行凈化,方法的回收率如圖3所示,隨著洗脫溶液中乙酸銨濃度的增加,矮壯素的回收率從10.0%升至95.5%;實驗還比較了洗脫溶液中的含水量對矮壯素回收率的影響,研究發(fā)現(xiàn),洗脫溶液含水量對矮壯素的回收率無影響,考慮到洗脫溶液需再濃縮,因此選擇甲醇(含100 mmol/L乙酸銨)作為洗脫溶液。

2.4 線性范圍與定量限

按1.2節(jié)方法制備豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、雞蛋、豬腎、牛肝、羊腎、雞肝、牛奶樣品的空白基質(zhì)溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為0.200、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0、100、200、500 μg/L的基質(zhì)匹配標準溶液(含內(nèi)標10.0 μg/L),對矮壯素和矮壯素-D4定量離子的峰面積之比(y)與矮壯素的質(zhì)量濃度(x,μg/L)進行線性回歸,繪制標準曲線,其線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見表2。

結(jié)果表明:矮壯素在0.200～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其線性相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 3,優(yōu)于李春梅等[12]方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。

在陰性樣品中添加矮壯素,以10倍信噪比(S/N≥)計算方法的定量限(LOQ),結(jié)果如表2所示,其LOQ為0.500 μg/kg,與李春梅等[12]方法相比具有更高的靈敏度。

2.5 準確度與精密度

通過對陰性樣品進行加標回收,考察方法的準確度和精密度。按照1.2節(jié)提取和凈化步驟,在豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、雞蛋、豬腎、牛肝、羊腎、雞肝和牛奶10種基質(zhì)樣品中分別添加定量的矮壯素標準溶液進行加標回收試驗,每個加標水平做6個平行(見表2),加標水平為0.500 μg/kg時的色譜圖見圖4。

結(jié)果顯示,在3個加標水平下,豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、雞蛋、豬腎、牛肝、羊腎、雞肝和牛奶中矮壯素的平均回收率為93.4%～101%,相對標準偏差為2.3%～8.0%。說明方法的準確度高,通用性好,且方法的回收率明顯優(yōu)于李春梅等[12]方法的回收率。

2.6 實際樣品的測定

運用本文建立的方法,對市售的豬肉、牛肉、羊肉、豬肝、豬腎、牛肝、羊腎、雞肉、鴨肉、雞胗、雞肝、雞翅、鴨腸、雞蛋、鴨蛋、牛奶共43份樣品進行矮壯素的殘留檢測。其中,5份不同廠家生產(chǎn)的雞蛋樣品中有1份檢出矮壯素,含量為1.31 μg/kg;6份不同廠家生產(chǎn)的牛奶樣品中有4份檢出矮壯素,含量分別為3.32、4.02、6.63和2.01 μg/kg,其余樣品未檢出矮壯素,所檢出樣品中矮壯素的含量均低于國家標準對其規(guī)定的最大殘留限量。

圖4 不同加標樣品中矮壯素(0.500 μg/kg)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of CCC (0.500 μg/kg)spiked in the different samples

表2 不同基質(zhì)中矮壯素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限、加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients (r2),LOQs,spiked recoveries and precisions of CCC in the different matrices (n=6)

Low,medium,high spiked levels:0.500,10.0,200 μg/kg for pork,beef,mutton;0.500,5.00,40.0 μg/kg for chicken;0.500,10.0,100 μg/kg for egg,chicken live;0.500,20.0,500 μg/kg for pig kidney,beef liver,sheep kidney,milk;y:peak area ratio of CCC to CCC-D4;x:mass concentration,μg/L.

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源性食品中矮壯素殘留的分析方法,方法操作簡單,凈化效果好,定性準確,靈敏度高,線性關(guān)系、準確度和精密度均滿足方法學(xué)指標,方法定量限完全滿足各國限量標準要求,可為動物源性食品中矮壯素的殘留檢測提供技術(shù)手段。