尹春園,孫明謙,金 龍,林 力,苗 蘭,劉建勛*

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所,中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091;2.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

心肌缺血(myocardial isochemia)是由于心臟的血液灌注量降低,導致心臟的供氧減少,心肌能量代謝異常,不能支持心臟正常工作的病理狀態(tài)[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的轉(zhuǎn)變,我國心血管疾病患者人數(shù)逐年增加。目前,心血管病是城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位,且農(nóng)村居民心血管病的死亡率逐年增加[2]。如何應用現(xiàn)代技術對心肌缺血的發(fā)病機制進行闡釋,是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要任務之一。

代謝組學(metabolomics)是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的新興組學技術,是系統(tǒng)生物學的重要組成部分,它通過檢測來自體液或組織中的小分子代謝物,來實現(xiàn)在疾病的早期診斷和治療檢測過程中的重要作用[3,4]。代謝物作為基因的下游產(chǎn)物,能夠最直接反映不同組之間的表型差異,從代謝層面上放大表達基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)層面的差異[5]。

本文利用液相色譜-四極桿軌道離子肼質(zhì)譜對異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)誘導的心肌缺血大鼠進行心肌組織和血清的靶向代謝組學研究和生物標志物的分析,揭示與心肌缺血有關的代謝通路,探索其發(fā)病機制。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與實驗動物

賽默飛UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司);Q ExactiveTM組合型四極桿質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司);22 R高速離心機(德國Mikro公司);低溫冰箱(美國Thermo公司);Mix-3000振蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司);Mikro 220R臺式高速冷凍離心機(德國Hettich公司)。

異丙腎上腺素鹽酸鹽(C11H17NO3·HCl,相對分子質(zhì)量247.72,純度高于99.0%,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸(HPLC級,美國Fisher Scientific公司,純度99%)。

SPF級健康雄性SD大鼠16只,體質(zhì)量200～220 g,購自北京斯貝福生物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0002,合格證號11401500048859。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院SPF級實驗動物中心,室內(nèi)溫度20～23 ℃,濕度40%～60%,晝夜循環(huán)12 h。

1.2 心肌缺血大鼠模型的建立及分組

所有大鼠適應性飼養(yǎng)3天后隨機分成兩組:正常對照組(8只)和模型組(8只)。模型組背部皮下注射ISO造成心肌缺血,給藥劑量為85 mg/kg,1次/天,兩次注射給藥時間間隔為24 h。

1.3 血清樣本采集與處理

第二次注射ISO后,大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛麻醉后腹主動脈取血,常溫下靜置0.5 h于4 ℃以3 000 r/min離心10 min后取上層血清存放于-80 ℃冰箱以備后續(xù)血清指標檢測和代謝組學進樣處理。

取100 μL血清,加300 μL乙腈,混勻振搖1 min,于4 ℃以13 200 r/min離心10 min后取上清液檢測。

1.4 組織樣本采集與處理

按1.3節(jié)所述取血完畢后剪下大鼠心臟,分取100 mg缺血明顯的心肌組織,轉(zhuǎn)移至勻漿管中,加入鋼珠、陶瓷珠高速振蕩30 min制備勻漿液,勻漿后,向心肌組織中加入1 mL乙腈,混勻提取1 h,所有樣本離心,離心條件為4 ℃、13 200 r/min、10 min,離心后取上清液檢測。

1.5 模型藥理指標

取1.3節(jié)中離心后的血清進行肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)的測定。

各組大鼠血清CK活力按照CK測定試劑盒說明書操作,采用日本臨床化學委員會(JSCC)標準化對應/國際臨床化學與檢驗醫(yī)學聯(lián)合會(IFCC)轉(zhuǎn)化法對應計算大鼠血清CK的活性。各組大鼠血清的LDH活性按照LDH測定試劑盒說明書操作,用IFCC法檢測大鼠血清的LDH活性。

各組大鼠血清中CK-MB活性按照CK-MB測定試劑盒說明書操作,采用免疫抑制法檢測CK-MB含量。

1.6 色譜條件

BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相的組成:A為含0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸的乙腈,B為含0.1%甲酸的水。梯度洗脫程序:0～6 min,20%B～50%B;6～9.5 min,50%B～20%B;9.5～12 min,20%B。柱溫:50 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:1 μL。

1.7 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式檢測,質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 050,噴霧電壓+3.7 kV,鞘氣壓力206 kPa (30 psi),輔助氣壓力69 kPa (10 psi),毛細管加熱溫度320 ℃,容積加熱蒸發(fā)溫度300 ℃。鞘氣和輔助氣均為氮氣。碰撞氣為氮氣,壓力為1.5 mTorr。

1.8 數(shù)據(jù)采集與預處理

采用ThermoFisher Corporation Xcalibur 2.2 SP1.48 (Waltham,MA)軟件執(zhí)行親水作用色譜(HILIC)-MS系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集,使用Skyline (64-bit,3.5.0.9319,MacCoss Lab,UW)軟件對MS原始數(shù)據(jù)進行處理,通過標準品比對識別氨基酸和相關化合物,建立了40余種極性小分子成分靶向分析方法[6]。通過Skyline軟件對各組樣本進行定量分析,再將數(shù)據(jù)輸入到MetaboAnalyst網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)進行歸一化預處理,所得數(shù)據(jù)最后應用SIMICAP+12.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥理指標評價

CK-MB與CK常被用作心肌損傷診斷的兩項生化指標,可間接反映心肌細胞遭受ISO損傷的程度。如表1所示:與正常對照組相比,模型組大鼠血清中CK-MB活力極顯著上升(p<0.01),表明大鼠心肌細胞明顯受損;與正常對照組相比,模型組大鼠血清中CK活力極顯著上升,LDH活力有上升趨勢,但無顯著差異。

表1 異丙腎上腺素致心肌缺血大鼠的CK、LDH、CK-MB活性Table 1 CK,LDH,and CK-MB activity in rats with ISO-induced myocardial ischemia n=8)

CK:creatine kinase;LDH:lactate dehydrogenase;CK-MB:creatine kinase isoenzyme MB.

** Compared with control group,p<0.01.

圖1 正離子模式下心肌缺血模型大鼠的(a)血清和(b)心肌組織樣本的LC-MS基峰圖Fig.1 LC-MS base peak chromatograms (BPC)of (a)a serum sample and (b)a heart tissue sample of rats with myocardial ischemia in positive ion mode

2.2 LC-MS分析結(jié)果

正離子模式下心肌缺血模型大鼠血清樣本及心肌組織的基峰圖見圖1a和見圖1b。對于LC-MS代謝組學研究,QC樣本由等量的所有樣本混合而成,所有樣本均取20 μL,混合成為均一的QC樣本。在代謝組學檢測過程中,每進6個樣本后進1個QC樣本。從QC樣本中選5個代表性的特征峰來評價整個實驗的穩(wěn)定性。在整個實驗中,tR的波動<0.2 min,m/z的偏差<10×10-6(10 ppm),離子強度變化的RSD<20%。結(jié)果顯示儀器的精密度良好,運行穩(wěn)定,實驗結(jié)果具有較好的重復性,在整個實驗過程中由儀器系統(tǒng)誤差引起的偏差較小,實驗數(shù)據(jù)偏差小,結(jié)果穩(wěn)定可靠。因此,本研究中所發(fā)現(xiàn)的代謝標志物含量差異能夠真實反映樣本組間本身的生物學狀態(tài)差異。

2.3 模式識別分析

分別采用PCA和PLS-DA對正常對照組和模型組心肌組織勻漿液和血清中的代謝物譜進行分析,得到相應的散點分布圖,見圖2。各組樣本呈現(xiàn)明顯的分離效果,表明二者的代謝物譜存在明顯差異。其中心肌組織的PLS-DA得分:R2(建模所用的主成分對原始數(shù)據(jù)的解釋度)=0.988,Q2(模型的可預測度)=0.949;血清的PLS-DA得分:R2=0.968,Q2=0.873。

圖2 大鼠心肌組織、血清樣本的PCA、PLS-DA模式識別圖Fig.2 PCA and PLS-DA pattern recognition of heart tissue and serum samples of ratsPCA:principal component analysis;PLS-DA:differentiation analysis of supervised partial least squares.

2.4 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst平臺對差異性代謝物進行代謝通路分析,心肌組織和血清樣本的代謝通路見圖3a和圖3b。

圖3 (a)心肌組織和(b)血清樣本差異性代謝物的代謝通路Fig.3 Summary of (a)heart tissue and (b)serum pathway analysis with metabolomics

2.5 差異性代謝物的篩選

根據(jù)PLS-DA模型第一主成分變量重要性值(VIP)結(jié)果,并結(jié)合單因素方差分析的p值,以VIP>1.2,p<0.05為條件篩選具有差異表達的代謝物,最終得到18種組間差異代謝物,見表2。

2.6 差異代謝物相關代謝途徑

與正常對照組比較,血清中鑒定出12個代謝差異性生物標志物,心肌組織中鑒定出12個代謝差異性生物標志物,二者共同含有的生物標志物為谷氨酰胺(glutamine)、羥脯氨酸(hydroxyproline)、鳥氨酸(ornithine)、甜菜堿(betaine)、核黃素(riboflavin)和?；撬?taurine)。

精氨酸(arginine)代謝相關:瓜氨酸(citrulline)和鳥氨酸是精氨酸代謝中的關鍵成分,它們的含量上升提示L-精氨酸-一氧化氮途徑出現(xiàn)異常。肌酸酐(creatinine)與羥脯氨酸也間接參與了該途徑的代謝。精氨酸是體內(nèi)合成一氧化氮(NO)的前體,在本研究中的含量也出現(xiàn)了下降(p<0.05)。精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化下,生成NO與瓜氨酸,同時精氨酸還是內(nèi)生性NO的唯一前體,該過程即L-精氨酸-一氧化氮途徑[7]。值得注意的是,NO的作用具有雙向性,能夠維持血管張力、增強心肌的舒張功能并對心臟收縮功能有利,但在病理條件下,其亦可對心肌組織造成危害。例如iNOS(inducible NOS,iNOS)在正常條件下不存在,在心肌缺血條件下被誘導生成,產(chǎn)生大量NO,它可與超氧陰離子生成具有細胞毒性的過氧化亞硝基(ONOO-),對心肌造成損傷[8,9]?？傊?精氨酸代謝途徑的異常可能提示NO生成的異常及可能導致的氧化應激損傷,而這些損傷導致相關的內(nèi)源性成分在心肌組織和血液中都呈現(xiàn)出不同程度的變化。

表2 大鼠心肌組織和血清的代謝差異性生物標志物Table 2 Differential metabolites in rat serum and heart tissue

* Change trend compared with control group.

能量代謝相關:在心肌缺血的過程中,能量代謝障礙是導致其進一步損傷的原因,纈氨酸(valine)為支鏈氨基酸,與能量代謝密切相關。纈氨酸為生糖氨基酸,其氧化產(chǎn)生的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的速率高于其他類型的氨基酸[10]。在心肌缺血的情況下,心肌能量的供給大幅下降。而纈氨酸等支鏈氨基酸可以為心肌提供能量補償,這可能是纈氨酸下降的原因。血液中丙氨酸(alanine)的含量出現(xiàn)上升,而丙氨酸可通過糖異生的途徑轉(zhuǎn)化為葡萄糖,其含量上升提示丙氨酸-丙酮酸-葡萄糖循環(huán)的紊亂,機體氧化功能障礙進一步加重[11]。在心肌缺血模型中肉堿(L-carnitine)的含量出現(xiàn)上升,肉堿穿梭系統(tǒng)將脂肪酸轉(zhuǎn)移到線粒體中,發(fā)生β-氧化,從而實現(xiàn)心臟的供能[12]。正常心肌能量供給60%～70%來自游離脂肪酸(FFA)氧化[13],而肉堿含量的變化提示這一系統(tǒng)出現(xiàn)了問題,正常心肌主要能量來源脂肪酸氧化受到了干擾。

作為高耗能的器官,心臟的能量代謝主要包括直接供能和磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)儲能兩種方式。直接供能是指心肌細胞攝取脂肪酸及葡萄糖在線粒體中通過氧化磷酸化產(chǎn)生大量的ATP來直接供能[14]。磷酸肌酸儲能是指磷酸肌酶穿梭系統(tǒng)調(diào)控ATP和PCr之間的能量轉(zhuǎn)換,在以下反應中形成磷酸肌酸:肌酸(creatine)+ATP←→PCr+二磷酸腺苷(ADP),即ATP的能量可被轉(zhuǎn)移并存儲于PCr中;當ATP需求增加時,CK同工酶可以快速地催化PCr與ADP的反應進而生成ATP和肌酸以供利用[15]。心肌缺血后能量的改變與PCr有關,它在高能量需求期間提供快速水解的ATP以供利用。研究表明,在心肌缺血的動物和患者中,不論心肌缺血的病因如何,PCr水平下降高達70%[16]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的分解產(chǎn)物,模型組中肌酐含量下降提示磷酸肌酸含量下降,符合心肌缺血能量代謝的物質(zhì)特點。

?；撬崾且环N存在于心肌細胞中的含硫氨基酸,屬于細胞保護劑。它通過調(diào)節(jié)離子通道和交換系統(tǒng)來降低Ca2+的超載,進而達到保護心肌的作用[17]。大劑量ISO可引起心率加快、心肌收縮力增強,心肌耗氧高于供氧,進而引發(fā)心肌缺血[18]。研究表明,經(jīng)ISO誘導后的心肌缺血缺氧損傷與氧自由基有密切關系,心肌缺血時,大量氧自由基產(chǎn)生,破壞膜結(jié)構(gòu),致膜通透性增加,造成細胞Ca2+內(nèi)流和Ca2+超載現(xiàn)象。?；撬峥赏ㄟ^保護膜脂免受自由基引起的過氧化、抑制Ca2+超載來保護缺血心肌[19,20]。在本研究中,血清和組織中均檢測到?；撬崴降南陆??；撬岜淮罅肯?表明心肌和血液中牛磺酸的代謝都出現(xiàn)了障礙,心肌中的Ca2+超載較為嚴重,心肌細胞損傷較為嚴重,血液中的含量也出現(xiàn)下降,提示對這一損傷難以進行全面的系統(tǒng)調(diào)節(jié)。

谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate)均屬于谷氨酰胺和谷氨酸代謝途徑,且兩者的含量都出現(xiàn)了下降,尤其谷氨酰胺在心肌和血清中的含量都出現(xiàn)了下降。谷氨酰胺是一種主要由骨骼肌和肝臟產(chǎn)生的氨基酸,在細胞中占碳和氮代謝的絕大部分[21]。文獻報道谷氨酰胺可以通過抑制炎癥反應通路核心介質(zhì)NF-κB的激活,來減少各種炎癥因子的生成,進而減輕炎癥因子對心肌的損傷,達到保護心肌的作用[22],同時谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要物質(zhì),而谷氨酰胺是其主要來源。谷胱甘肽系統(tǒng)是體內(nèi)細胞減少氧化應激的主要機制之一。谷氨酰胺能夠通過誘導谷胱甘肽的合成保護心肌細胞免受氧化應激的損傷,從而有利于缺血再灌注損傷后心肌細胞的恢復[23]。其在心腦血管疾病中亦被研究證明具有明顯的抗氧化和清除自由基的作用,對心肌缺血具有保護作用[24]。本研究中,谷氨酰胺含量的下降,可能與心肌缺血中氧化應激壓力增大和炎性反應密切相關。

3 結(jié)論

本文利用代謝組學的分析手段檢測異丙腎上腺素誘導的心肌缺血大鼠血清和心肌組織代謝物的變化,通過多元統(tǒng)計分析,確定了牛磺酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、鳥氨酸等18個差異代謝物,這些代謝物主要與能量代謝、精氨酸代謝、谷氨酰胺和谷氨酸代謝等途徑有關,揭示了心肌缺血的發(fā)病機制,為臨床早期疾病預測和診斷提供了依據(jù)。