張喜懿， 溫貴蘭*， 歐德淵， 陳 廣， 張小波， 汪德生， 文 明， 胡 璇， 孫 蕓， 劉蔓蔓

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550016)

馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒 (Marek’s disease virus，MDV)引起雞的1種淋巴組織增生性疾病，其特征是病雞的外周神經(jīng)、虹膜、各內(nèi)臟器官形成腫瘤病灶[1]。Josebp Marek于1907年首次報道該病，Campbell J G等1961年正式將該病命名為雞馬立克氏病[2]。Churchill A E等[3]1967年首次從接種病雞細胞的培養(yǎng)物中分離出MDV。此后世界各地相繼報道有馬立克病的發(fā)生和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]。MDV共有3種血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型 (MDV-2)、血清3型 (MDV-3)，但只有MDV-1可致瘤或致病[5]。根據(jù)MDV-1致病性的強弱，又可將其分為溫和型(mild MDV，mMDV)、強毒型(virulent MDV，vMDV)、超強毒型(very virulent MDV，vvMDV)、特超強毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)[6]。相關(guān)研究表明，與MDV致腫瘤相關(guān)的基因有meq、132-bpr、pp38/pp24、v-IL8等，而132-bpr基因與Meq基因是MDV-1所特有的，其中meq基因是公認的主要致瘤基因，與MDV-1強弱毒株致瘤性的不同有關(guān)[7，8]。本試驗從疑似MD貴州矮腳黃雞的肝臟病料中擴增出MDVmeq基因片段，并對該片段進行克隆及遺傳進化分析，為豐富貴州省MDV毒株信息庫及防控MD提供參考。

1 材料

1.1 檢測病料肝臟病料采自貴陽市某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的疑似MD矮腳黃雞，保存于貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室(-80 ℃冰箱)。

1.2 主要試劑瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司]，HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒(購自康為世紀生物科技有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、2×ESTaqDNA Mix、pMD19-T Vector、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker[購自寶生物工程(大連)有限公司]，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器電泳槽(DYCZ-HOB型)、電泳儀電源(DYCZ-8C型)(購自北京市六一儀器廠)，SYGENE電泳凝膠成像儀(購自GENE公司)，多功能梯度PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal Cycler)(購自ABI公司)，37 ℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(BD53)(購自BINDER公司)。

2 方法

2.1 引物信息參考GXY2株meq基因(GenBank登錄號：EF546430)設計MDVmeq，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

2.2 MDV核酸PCR檢測根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書分別提取總DNA和總RNA，再根據(jù)HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。使用MDVmeq特異引物對核酸樣品進行PCR擴增?？偡磻w系20 μL：上、下游引物(10 mol/μL)各1.0 μL，2×ESTaqDNA聚合酶10 μL，核酸2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：94 ℃ 預變性2 min；94 ℃ 變性45 s，60.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

2.3 MDVmeq基因克隆將MDVmeq的PCR產(chǎn)物進行膠回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化細胞接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～24 h至長出菌落，挑取6個單菌落接種于含氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)12～16 h。取培養(yǎng)的克隆菌液2 μL進行PCR鑒定(反應體系及條件同2.2)，提取陽性克隆菌液質(zhì)粒送華大基因測序。

2.4 MDVmeq基因遺傳進化分析將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進行比對，利用MegAlign軟件分析其同源性、氨基酸缺失位點，并構(gòu)建遺傳進化樹。參考毒株信息見表2。

表2 MDV meq基因參考毒株信息

3 結(jié)果

3.1 MDV核酸檢測結(jié)果由圖1可見：經(jīng)PCR擴增，于1 020 bp處出現(xiàn)MDVmeq基因特異擴增條帶，長度與預擴增片段相符，表明病雞存在MDV感染，將該片段命名為MDV GZ 2019meq。

3.2 MDVmeq基因克隆菌液PCR鑒定結(jié)果由圖2可見：各克隆菌液在1 020 bp處均出現(xiàn)特異擴增條帶，與目的基因大小相符。

3.3 MDV GZ 2019meq基因同源性分析測序結(jié)果顯示MDV GZ 2019meq基因全長1 020 bp，共編碼339個氨基酸，將其與GenBank登錄的10株MDV參考株的meq基因進行核苷酸序列、推導氨基酸序列同源性比對。由圖3可見：MDV GZ 2019meq基因與參考毒株的核苷酸同源性為98.7%～99.8%。其與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.8%)，與國內(nèi)強毒MDV分離株J-1株、美國特超強毒MDV分離株648A株的同源性最低(98.7%)。由圖4可見：MDV GZ 2019meq基因與參考毒株的推導氨基酸同源性為96.7%～99.4%。其與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.4%)，與荷蘭溫和型MDV分離株CVI988株的同源性最低(96.7%)。

3.4 MDV GZ 2019meq基因核苷酸序列遺傳進化樹分析由圖5可見：MDV GZ 2019meq基因與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株的親緣關(guān)系最近，與美國特超強毒MDV分離株TK株、N株、648A株的親緣關(guān)系最遠。

3.5 MDV GZ 2019meq基因推導氨基酸序列分析將MDV GZ 2019meq基因推導氨基酸序列與GXY2等10株參考毒株進行比對，發(fā)現(xiàn)共有5個突變位點，分別為第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)(見圖6)。除第63位氨基酸突變是MDV GZ 2019meq基因所獨有以外，其余突變位點與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株完全一致。

4 討論

4.1meq基因是MDV-1中特有的主要致腫瘤基因，關(guān)于該基因的國內(nèi)外報道較多，但其致瘤機制目前仍不清楚[9]。meq基因相對保守，在不同致病力毒株之間其核苷酸和氨基酸序列的同源性均較高。本試驗中MDV GZ 2019meq基因的核苷酸、推導氨基酸同源性分析結(jié)果表明，其與10株不同致病力MDV參考毒株的核苷酸序列和推導氨基酸序列同源性分別為98.7%～99.8%、96.7%～99.4%。強毒株MDVmeq基因全長1 020 bp，編碼339個氨基酸；而疫苗弱毒株(如CVI988株、814株)的meq基因在第575～577位有3個堿基缺失(即CAC)，導致了1個脯氨酸的缺失[10]。本試驗分離的MDV GZ 2019meq基因長度為1 020 bp，在第575～577位不存在堿基缺失，與大部分強毒株的特性一致，說明其具有強毒株的特征。

4.2相關(guān)文獻報道，低致病力MDV毒株具有脯氨酸重復區(qū)，而強毒株第153位、176位、217位的脯氨酸存在突變，破壞了meq基因原有的脯氨酸重復區(qū)，導致了致病力的變化[11]。本試驗中MDV GZ 2019meq基因共有5個氨基酸突變位點，分別在第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)，其中第176位和217位氨基酸的突變破壞了脯氨酸重復區(qū)，具有強毒株特性；此外，除第63位氨基酸突變是MDV GZ 2019meq基因所獨有以外，其余突變位點均與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株完全一致，故推測其為強毒株。

5 結(jié)論

本試驗從疑似MD貴州矮腳黃雞的肝臟病料中擴增出MDVmeq基因，并進行克隆及序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因長度為1 020 bp，可編碼339個氨基酸；與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株的核苷酸序列同源性高達99.8%；存在5個氨基酸突變位點，除第63位突變是MDV GZ 2019meq基因所獨有以外，其余突變位點均與國內(nèi)特超強毒MDV分離株GXY2株完全一致，推測其為強毒株，具體致病性強弱還需進一步研究。