賈麗萍，王宏勛，陸俊宇，楊云波，高 源，王 興

(1.玉溪市林業(yè)和草原局，云南 玉溪 653100；2.玉溪市紅塔山自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南 玉溪 653100)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種廣譜性昆蟲病原真菌，玉溪市紅塔山自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局于1979年開始采用固體培養(yǎng)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)球孢白僵菌。菌種的保藏及復(fù)壯是日常生產(chǎn)中一個非常重要的環(huán)節(jié)，而菌種在保藏或使用過程中，經(jīng)過多代培養(yǎng)后會產(chǎn)生退化現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌絲生長慢，呈稀疏的長毛狀，菌苔薄，用接種針挑取孢子時往往挑到一層白色的薄皮，孢子產(chǎn)生時間推遲，產(chǎn)孢量減少，有時在菌苔表面出現(xiàn)一些小包狀的突起——菌絲束或菌絲孢叢，在其上產(chǎn)生不育孢子，導(dǎo)致毒力降低。一般菌種經(jīng)過轉(zhuǎn)接7～8代后必須進(jìn)行菌種復(fù)壯，使其恢復(fù)或提高原有的特性。本文采用最常用的活蟲復(fù)壯法、蟲尸復(fù)壯法對球孢白僵菌菌種進(jìn)行復(fù)壯試驗(yàn)分析，研究在生產(chǎn)實(shí)踐中，究竟采用哪一種復(fù)壯法簡單易行，且能降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌種

試驗(yàn)所用菌種為自產(chǎn)球孢白僵菌一級菌種，菌種保藏時間5年，保藏方法為水浸保藏法，保藏溫度為4℃。

1.1.2儀器

手提式壓力蒸汽滅菌器，規(guī)格型號YXQG04B，由淄博高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)新華醫(yī)療科技園制造；醫(yī)用型超凈工作臺，規(guī)格型號SW-J,由中日合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司制造。

1.1.3其他材料

試驗(yàn)材料包括鑷子、酒精燈、醫(yī)用搪瓷托物盤、蒸餾水、棉球塞、白橡膠塞、養(yǎng)蟲箱、枝剪、剪刀、培養(yǎng)皿、試管、橡皮手套、接種針、試管、電磁爐。

1.1.4供試蟲源

2019年4月19日采自云南省玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)雞窩土官田后山地4～6齡思茅松毛蟲幼蟲。其中，采集的活蟲放在干凈的養(yǎng)蟲箱內(nèi)飼養(yǎng)，活蟲采集時要注意避免人為造成幼蟲死傷，盡量做到當(dāng)天采集當(dāng)天處理。

1.2 復(fù)壯方法

1.2.1活蟲復(fù)壯法

將林間采集到的鮮活思茅松毛蟲4齡幼蟲20只分別放入2個養(yǎng)蟲箱內(nèi)，每箱裝10只。從冰箱中取出待復(fù)壯的球孢白僵菌菌種，用事先消好毒的接種針或鑷子將孢子粉輕輕刮下，按需稱量倒入裝有蒸餾水的三角瓶中，加入適量洗衣粉充分搖勻，最終稀釋成含孢子量2億個/mL的菌液，將稀釋好的菌液噴灑在養(yǎng)蟲箱內(nèi)的活蟲和針葉上，噴灑的劑量以箱內(nèi)針葉潮濕但不滴水為宜，為提高養(yǎng)蟲箱內(nèi)的空氣濕度，每個箱中放一杯清水。在另一養(yǎng)蟲箱內(nèi)設(shè)同等數(shù)量的活蟲噴清水進(jìn)行飼養(yǎng)對照。平常管理注意及時更換新鮮的油杉枝條或云南松松枝，并觀察感病情況，記錄思茅松毛蟲死亡時間和數(shù)量。將感病死亡的思茅松毛蟲用蒸餾水洗下其菌絲孢子，同樣的方法再噴到鮮活的蟲體上。如此重復(fù)2次，選取最后一次感病蟲體進(jìn)行分離純化保存。

1)菌種的分離提純

采用活蟲復(fù)壯法進(jìn)行菌種復(fù)壯時，活蟲在感病的過程中往往會感染大量其它雜菌，因此需要對復(fù)壯過的蟲體進(jìn)行分離，以得到純化的球孢白僵菌菌種。

2)分離方法

采用組織分離法進(jìn)行分離。于無菌接種箱中或超凈工作臺上將用活蟲復(fù)壯的感病僵蟲(未長出孢子粉)在酒精燈火焰下進(jìn)行表皮消毒，殺死表皮雜菌，然后將蟲尸剪成0.5 cm大小的方塊，放置到事先準(zhǔn)備的盛有0.1%L汞水的培養(yǎng)皿中浸泡消毒5 min，然后在裝有無菌水的培養(yǎng)皿中清洗，取出放置于消毒濾紙上待用，將濾去水分的組織塊接種于事先準(zhǔn)備好的斜面試管中進(jìn)行培養(yǎng)，組織塊長出菌落后挑取未受感染的進(jìn)行轉(zhuǎn)接，反復(fù)2～3次可得到純化的菌種。

1.2.2蟲尸復(fù)壯法

將采集到的5～6齡思茅松毛蟲幼蟲20只用開水燙死，用濾紙吸掉蟲體上的水分，在酒精燈火焰上去掉過長的體毛，以便接種后孢子容易接觸到蟲體。用酒精擦一遍蟲體進(jìn)行體表消毒，將處理好的蟲尸裝入試管里，每管裝一只幼蟲尸體，塞上試管塞，放平待用。用牛皮紙或耐高溫的塑料紙包好平放于高壓滅菌鍋內(nèi)，保持鍋內(nèi)壓力0.14 MPa、溫度126℃、滅菌30 min，滅菌結(jié)束后，取出置于超凈工作臺上進(jìn)行冷卻并用紫外燈照射30 min進(jìn)行處理。當(dāng)蟲體溫度達(dá)到28～30℃時，挑取待復(fù)壯的菌種孢子進(jìn)行接種培養(yǎng)。培養(yǎng)15～20 d后，待蟲體上的孢子成熟后，再挑取蟲體上的孢子接種到新的蟲尸上，如此反復(fù)3次。最后一次復(fù)壯的蟲尸放冰箱中保藏待用，生產(chǎn)中需要時取出進(jìn)行擴(kuò)轉(zhuǎn)。

1.2.3接種培養(yǎng)

1)斜面培養(yǎng)基制作

稱取馬鈴薯200 g(去皮洗凈)，葡萄糖20‰，蛋白胨10‰，瓊脂17‰，MgSO41‰,KH2PO40.5‰,水 1 000 mL。將馬鈴薯切成片，加水 1 000 mL煮沸20 min,然后用雙層紗布過濾，取馬鈴薯汁，不足 1 000 mL加水補(bǔ)足，然后依次加入葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、MgSO4、KH2PO4,加熱至全部溶解，用漏斗分裝到試管中待用。培養(yǎng)基的分裝劑量以占試管總高度的 1/4～1/3 為宜。

2)固體培養(yǎng)基制作

按所需量稱取小麥三級面粉 1 000 g、高錳酸鉀0.1 g、水250 mL,將高錳酸鉀倒入水中溶解攪拌均勻，然后慢慢加入裝有面粉的盆中混拌揉勻，揉成有韌性的面團(tuán)，用搟面棒搟成薄片，切成10 cm×0.5 cm×0.5 cm左右的長條裝入試管，塞上棉塞；同時也用此方法將薄片按培養(yǎng)皿大小制成培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基。

將準(zhǔn)備好的思茅松毛蟲蟲尸、斜面培養(yǎng)基和制備好的固體培養(yǎng)基、面塊做成的培養(yǎng)皿放入高壓鍋內(nèi)消毒。保持鍋內(nèi)壓力0.14 MPa、溫度126℃、滅菌30 min，滅菌結(jié)束后，取出置于超凈工作臺上進(jìn)行冷卻并用紫外燈照射30 min進(jìn)行處理。

3)接種

斜面管接種方法：對滅菌好的斜面培養(yǎng)基須在無菌條件下(即在接種箱內(nèi))進(jìn)行接種，接種前須用酒精對雙手及接種工具進(jìn)行消毒，然后于酒精燈火焰下再次對接種針進(jìn)行火燒滅菌，接種針冷卻后才能挑取菌種孢子粉進(jìn)行轉(zhuǎn)接，如果試管壁上有冷凝水，先用無菌棉球?qū)⑵洳粮?，然后挑取孢子粉在培養(yǎng)基上從底部至頂部劃線，力度要確保培養(yǎng)基不被劃破。

固體培養(yǎng)基試管的接種方法：先將滅菌好的固體培養(yǎng)基放在超凈工作臺箱內(nèi)進(jìn)行接種，取一支準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)接種試管，于酒精燈火焰下用酒精對整支試管進(jìn)行擦拭消毒，左手握管，用右手小手指和無名指夾住試管棉塞，用酒精棉球?qū)芸趦?nèi)壁進(jìn)行消毒，同時取一支待接種的試管用左手食指和中指夾住，無名指和小指夾住轉(zhuǎn)接種試管，大拇指同時握住試管，接種針在酒精燈火焰下燒紅消毒，迅速放入裝有面條培養(yǎng)基的試管中冷卻，然后輕輕放進(jìn)轉(zhuǎn)接種試管內(nèi)，挑取孢子粉放進(jìn)待接種試管培養(yǎng)基上，從試管最底部拉至培養(yǎng)基頂部，并對面條培養(yǎng)基進(jìn)行攪動，使孢子粉能在整個培養(yǎng)基上分布均勻，最后塞上棉塞，再取另一支試管進(jìn)行接種。

4)接種后培養(yǎng)

將接種后的斜面試管、固體培養(yǎng)基試管平行擺放于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室采用空調(diào)將室溫控制在25℃，在培養(yǎng)期間注意觀察污染情況，如果發(fā)現(xiàn)有污染情況，及時移出，培養(yǎng)15～20 d即可得到成熟的斜面菌種和固體培養(yǎng)基菌種。

1.2.4復(fù)壯菌種的長勢對比

1)采用蟲尸復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接入不同培養(yǎng)基

在無菌的超凈工作臺中用蟲尸復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接入已消毒滅菌的45支試管固體培養(yǎng)基，再接入30支思茅松毛蟲蟲尸做成的培養(yǎng)基，接完后統(tǒng)一放入自然室溫(25℃)培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)觀察記錄(接種時間為2019年5月15日15時)。

2)采用活蟲復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接入不同培養(yǎng)基

在無菌的超凈工作臺中用活蟲復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接入已消毒滅菌的45支試管固體培養(yǎng)基，再接入30支思茅松毛蟲蟲尸做成的培養(yǎng)基，接完后統(tǒng)一放入自然室溫(25℃)培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)觀察記錄；在培養(yǎng)期間注意觀察雜菌污染情況，發(fā)現(xiàn)污染及時移出，并做好觀察記錄(接種時間為2019年5月15日16時)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活蟲復(fù)壯法結(jié)果

噴灑菌液3 d，供試幼蟲行動遲緩，有明顯感病癥狀，到第5天，可見孢子在蟲體上點(diǎn)狀萌發(fā)，第10天后可見粉狀孢子，這些帶雜菌的孢子再進(jìn)行第二次活蟲噴灑的時候，雜菌的數(shù)量也在增長，反復(fù)3次得到的白僵菌孢子需要進(jìn)行轉(zhuǎn)管提純。因此該方法復(fù)壯所需時間周期長，工作量大。

2.2 蟲尸復(fù)壯法結(jié)果

在蟲尸上接種，第2天就萌發(fā)，長勢快，第4天已全部長滿蟲尸培養(yǎng)基。用蟲尸作培養(yǎng)基，由于是天然培養(yǎng)基，具備豐富的碳源、氮源、礦質(zhì)元素，再加上經(jīng)過高溫消毒，幾乎無污染，反復(fù)2～3次就能得到復(fù)壯菌種。該方法復(fù)壯周期短，工作量小。

2.3 同一種復(fù)壯方法接入不同培養(yǎng)基上長勢及污染情況對比

2.3.1蟲尸復(fù)壯的球孢白僵菌菌種

采用蟲尸復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接種在不同培養(yǎng)基上，其長勢和污染程度存在差異。蟲尸培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基，含有天然的有機(jī)物質(zhì)，具備豐富的碳源、氮源、礦質(zhì)元素，其優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)較豐富，且母種是蟲尸，具有豐富的動物性氮源；固體試管培基由于氮源來源于小麥，氮源不及蟲尸培養(yǎng)基豐富，所以長勢較慢，2種培養(yǎng)基由于母種是蟲尸復(fù)壯球孢白僵菌菌種，所以抗性較強(qiáng)，在培養(yǎng)過程中都無污染情況(表1)。

表1 采用蟲尸復(fù)壯球孢白僵菌菌種接入不同培養(yǎng)基上觀察記錄

2.3.2活蟲復(fù)壯的球孢白僵菌菌種

采用活蟲復(fù)壯方法接種在不同培養(yǎng)基上，其長勢和污染程度存在差異。蟲尸培養(yǎng)基較固體試管培養(yǎng)基萌發(fā)長勢快，蟲尸培養(yǎng)基由于是天然培養(yǎng)基，其氮源比固體培養(yǎng)基的豐富，母種經(jīng)提純后獲得，且無污染，但接種在2種培養(yǎng)基上，其固體試管培養(yǎng)基萌發(fā)慢，培養(yǎng)中1支受污染，可能在接種操作過程中受到雜菌的污染(表2)。

表2 采用活蟲復(fù)壯的球孢白僵菌菌種接入不同培養(yǎng)基上觀察記錄

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，待復(fù)壯菌種是采用浸菌種保藏法保藏5年的球孢白僵菌菌種，把孢子接種到林間采集4～6齡思茅松毛蟲上，采用蟲尸復(fù)壯法和活蟲復(fù)壯法進(jìn)行復(fù)壯，2種方法都可使衰退的菌種得到恢復(fù)。其中，蟲尸復(fù)壯法最優(yōu)，操作簡單，污染小，轉(zhuǎn)管容易；活蟲復(fù)壯法在害蟲自然感病的過程中容易感染其他雜菌，需要經(jīng)過多次提純才能使用。

球孢白僵菌作為一種活體真菌，其生長發(fā)育的條件包括營養(yǎng)物質(zhì)條件和環(huán)境條件。碳、氮、磷被稱為培養(yǎng)球孢白僵菌的3要素，因此選擇好培養(yǎng)基，能供給微生物生長繁殖的基質(zhì)。在本試驗(yàn)中2種復(fù)壯后的球孢白僵菌菌種接種在不同的培養(yǎng)基上對比，以蟲尸為培養(yǎng)基進(jìn)行接種，因其能提供較好的動物性氮源，以保證菌株的生產(chǎn)活力，所以長勢較快，長勢和污染程度均優(yōu)于固體培養(yǎng)基。而固體培養(yǎng)基在制作過程中加入0.1 g 的高錳酸鉀，能很好地抑制其他雜菌的污染，但可能在接種培養(yǎng)中也會推遲球孢白僵菌的孢子萌發(fā)時間，因此用蟲尸培養(yǎng)基接種培養(yǎng)要優(yōu)于固體培養(yǎng)基接種。