吳章，呂望，陳新國，金爽，陳玲瓏，盧中秋

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

糖尿病性心肌?。╠iabetes cardiomyopathy，DCM）是指糖尿病引起的心肌病變，是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，可引發(fā)心肌性壞死，最終進(jìn)展為心力衰竭、心律失常和心源性休克，因此也成為糖尿病患者死亡的主要原因之一[1-2]。氧化應(yīng)激和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）積聚是誘導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥和糖尿病血管疾病的重要因子，甚至可能是糖尿病血管病變最重要的誘發(fā)因素。內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞暴露于蛋白和脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物中，造成細(xì)胞凋亡并成為糖尿病患者的主要病理改變之一[3-4]。

雷公藤紅素（Celastrol）是傳統(tǒng)中藥雷公藤中的一種單體，是從雷公藤屬及南蛇藤屬植物中分離出的五環(huán)三萜類色素，具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制、抑制血管形成以及抗腫瘤等藥理活性[5]。相關(guān)研究顯示，雷公藤紅素可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生，例如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8，并通過與cdc37蛋白以及p23分子伴侶相互作用阻斷熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）的生物學(xué)活性[6]，可以發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用[7]，但是否對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究通過高糖條件培養(yǎng)大鼠心肌H9C2細(xì)胞，并用雷公藤紅素進(jìn)行干預(yù)，分析雷公藤紅素對H9C2細(xì)胞生長抑制率、ROS產(chǎn)生以及炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討雷公藤紅素對于高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并為下一步的研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠心肌H9C2細(xì)胞株購于南京凱基生物公司，雷公藤紅素購于上海源葉公司；ROS熒光探針購于南京凱基生物公司；抗大鼠GAPDH、NFκB P65、TGF-β和IL-1β購于美國Abcam公司；TRNzol RNA提取試劑、2×Taq PCR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（with gDNase）和DNA Marker購于天根生化科技（北京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于南京凱基生物公司；胎牛血清購于美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):大鼠心肌H9C2細(xì)胞用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長至90%左右，PBS清洗后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基吹打懸浮細(xì)胞，按1:3 比例加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105細(xì)胞/mL，分別取100 μL和2 mL鋪種于96孔或者6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力:實(shí)驗(yàn)設(shè)立低糖組、等滲組、高糖組、10 ng/mL雷公藤紅素組和100 ng/mL雷公藤紅素組。當(dāng)細(xì)胞生長至90%以上覆蓋率后，用胰蛋白酶消化H9C2細(xì)胞，分別用含10%胎牛血清的低糖DMEM（5.6 mmol/L）和高糖DMEM培養(yǎng)基（30 mmol/L）終止消化并吹打細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)后計(jì)數(shù)，鋪種100 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，鋪種密度為1 000個(gè)/孔。等滲組中，加入甘露醇溶液（24.4 mmol/L）至低糖培養(yǎng)基鋪種的96孔板中；干預(yù)組中，加入雷公藤紅素至高糖培養(yǎng)基鋪種的96 孔板中，使終濃度分別為10 ng/mL和100 ng/mL。 37 ℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h后加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去掉培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO后并吹打均勻使得結(jié)晶紫充分溶解，酶標(biāo)儀上檢測490 nm處吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平:實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)步驟同上，低糖組和等滲組用低糖DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，高糖組、10 ng/mL雷公藤紅素組和100 ng/mL雷公藤紅素組用高糖DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106細(xì)胞/mL，取2 mL鋪種于6孔板中；等滲組中，加入甘露醇溶液（24.4 mmol/L）至低糖培養(yǎng)基鋪種的6孔板中；10 ng/mL雷公藤紅素組和100 ng/mL雷公藤紅素組中，加入雷公藤紅素至高糖培養(yǎng)基鋪種的6孔板中，終濃度分別為10 ng/mL和100 ng/mL。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)48 h后用無EDTA的胰蛋白酶消化，并用完全培養(yǎng)基吹打制成單細(xì)胞懸液；參照說明書加入ROS熒光探針使終濃度為10 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)30 min后離心去上清液，加入1 mL的培養(yǎng)基繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)30 min；離心去上清，用PBS清洗2次；離心后并加入500 μL PBS，混勻后進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞NF-κB、TGF-β和IL-1β mRNA的表達(dá):實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞鋪種方法同上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并加入TRNzol試劑，按照產(chǎn)品說明書步驟抽提總RNA，用DEPC水溶解并測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反應(yīng)液和設(shè)置反應(yīng)程序，取1 μg RNA溶液并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；用2×Taq PCR Mastermix試劑配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，并加入等體積的cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為:GAPDH正向:5’-ACTGGCCACGCTAATCTGAC-3’，反向:5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’；NF-κB正向:5’-GCCACTAAATCCAACACAGG-3’，反向:5’-CATCTTCACA TCTCCCGTAAC-3’；TGF-β正向:5’-TCAGACATTCGGGAAGC AG-3’，反向:5’-TTCCGTCTCCTTGGTTCAG-3’；IL-1β正向:5’-TTCAGGAAGGCAGTGTCAC-3’，反向:5’-GGAGAATA CCACTTGTTGGC-3’。擴(kuò)增完成后用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照后用ImageJ軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，并計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞中NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達(dá):實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞鋪種方法同上，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并加入含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞并進(jìn)行總蛋白提取，BCA法測定各組細(xì)胞裂解液中總蛋白濃度，加入含有β-巰基乙醇的5×Loading Buffer，混勻后沸水浴10 min，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜，10%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，配置一抗反應(yīng)液，于孵育盒中覆蓋PVDF膜，4 ℃孵育過夜。GAPDH、NF-κB、TGF-β和IL-1β抗體按照1:5 000進(jìn)行比例稀釋，并于4 ℃孵育過夜，用PBST緩沖液清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，清洗后用ECL試劑孵育PVDF膜，暗室中進(jìn)行曝光顯影。ImageJ分析各條帶灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖抑制H9C2細(xì)胞生長 MTT結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h和48 h后，與低糖組相比（OD490 分別為0.785±0.015和0.855±0.020），高糖組（0.681±0.012和0.773±0.015）的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），提示高糖培養(yǎng)對H9C2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，等滲組（0.742±0.016和0.861±0.072）與低糖組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 雷公藤紅素干預(yù)改善高糖對H9C2 細(xì)胞的生長抑制作用 雷公藤紅素組分別用10 ng/mL和100 ng/mL的雷公藤紅素干預(yù)高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入雷公藤紅素干預(yù)后可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力（OD490分別為2.338±0.045和2.449±0.064），與高糖組（2.031±0.107）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示雷公藤紅素干預(yù)可改善高糖對細(xì)胞的生長抑制作用。

2.3 高糖誘導(dǎo)和雷公藤紅素干預(yù)對H9C2細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響 H9C2細(xì)胞經(jīng)ROS熒光探針DHE孵育后，通過流式細(xì)胞儀于495 nm激發(fā)光條件下檢測細(xì)胞的熒光活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后檢測到的熒光強(qiáng)度明顯高于低糖組和等滲組（P ＜0.05），但是高糖組中細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為100 ng/mL的雷公藤紅素后，熒光探針染色陽性細(xì)胞比例較高糖組明顯降低，直方圖顯示峰值明顯發(fā)生左移，見圖1。

2.4 高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中NF-κB、TGF-β和IL-1β mRNA上調(diào)表達(dá) 高糖培養(yǎng)48 h的H9C2細(xì)胞經(jīng)RTPCR實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB、TGF-β和IL-1β的mRNA表達(dá)水平高于低糖組和等滲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而低糖組和等滲組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.5 雷公藤紅素干預(yù)抑制高糖誘導(dǎo)NF-κB、TGF-β和IL-1β mRNA上調(diào)表達(dá) 高糖培養(yǎng)H9C2細(xì)胞的同時(shí)加入終濃度為10 ng/mL和100 ng/mL的雷公藤紅素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示10 ng/mL和100 ng/mL雷公藤紅素組中NF-κB、TGF-β和IL-1β的mRNA表達(dá)水平與高糖組相比，均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。這提示雷公藤紅素可能對參與纖維化和細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)具有調(diào)控作用。

2.6 高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白水平上調(diào)表達(dá) 高糖組、低糖組和等滲組H9C2細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示高糖組中NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白相對表達(dá)量均明顯高于低糖組和等滲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖1 雷公藤紅素干預(yù)高糖對H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.7 雷公藤紅素干預(yù)抑制高糖誘導(dǎo)NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白上調(diào)表達(dá) Western blot結(jié)果提示10 ng/mL和100 ng/mL雷公藤紅素組中H9C2細(xì)胞的NF-κB、TGF-β和IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

3 討論

線粒體氧化應(yīng)激被認(rèn)為是發(fā)展DCM的重要因素，處于高糖環(huán)境中的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），與其受體結(jié)合后誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS，激活NF-κB信號途徑誘發(fā)多種病理變化，在超氧化物歧化酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模型中，糖尿病視網(wǎng)膜病變和DCM明顯受抑制[8-9]。

圖2 高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中NF-κB、TGF-β和IL-1β mRNA表達(dá)

圖4 高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達(dá)

圖5 雷公藤紅素干預(yù)抑制NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白上調(diào)表達(dá)

有研究顯示，雷公藤紅素可以減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB的活化，TNF-α及IL-1β的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[10]。YU等[11]通過體內(nèi)和體外研究表明雷公藤紅素能抑制NLRP3炎性小體的活化以及下游的Caspase-1和IL-1β的表達(dá)，從而提示雷公藤紅素具有治療NLRP3炎性小體依賴的炎癥疾病。還有研究指出雷公藤紅素增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量、線粒體膜電位和脂肪酸的氧化，從而提高線粒體的生物學(xué)功能，另外雷公藤紅素可以增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量、維持線粒體膜電位、增強(qiáng)枸櫞酸合酶活性并降低線粒體超氧化物，從而改善線粒體功能[12-13]。

盡管以上文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤紅素具心肌保護(hù)、抗炎和增強(qiáng)線粒體功能等作用，但是高糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷相關(guān)研究尚未見報(bào)道，本研究通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素干預(yù)組細(xì)胞活性高于高糖組細(xì)胞，提示雷公藤紅素可以減輕高糖培養(yǎng)對H9C2細(xì)胞生長抑制作用，且對雷公藤紅素的作用具有濃度依賴性。高糖毒性可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，本研究也通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于低糖組和等滲組，雷公藤紅素干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯低于高糖組，提示雷公藤紅素可以降低高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，但是關(guān)于雷公藤紅素干預(yù)ROS產(chǎn)生的作用機(jī)制本研究尚未進(jìn)行探討，可能與增強(qiáng)線粒體功能和TCA循環(huán)有關(guān)[12]。HANSEN等[14]通過對雷公藤紅素處理/未處理細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素處理后細(xì)胞中與線粒體相關(guān)的抗氧化蛋白和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白明顯上調(diào)。ZHANG等[15]的研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過抑制mTOR信號途徑維持AMPK活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生從而保護(hù)鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。HU等[16]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nur-77從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至線粒體，并與其中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor ne-crosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）結(jié)合抑制其泛素化連接酶活性，從而減輕炎癥反應(yīng)。

高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大已經(jīng)得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。在DCM的進(jìn)程中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS將影響DCM的整個(gè)病理進(jìn)程，包括心肌肥大、纖維化和心臟收縮功能障礙以及心衰[17-18]。鐘明等[19]研究表明纈沙坦通過抑制TSP-1/TGF-β1信號途徑逆轉(zhuǎn)大鼠DCM心肌間質(zhì)纖維化進(jìn)程，大鼠左室心肌組織膠原含量及TGF-β1表達(dá)量均明顯降低。雷公藤紅素還可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，其分子機(jī)制可能是雷公藤紅素具有抑制TGF-β1/Smads信號途徑所介導(dǎo)的[20]。在本研究中，高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平明顯較低糖組和等滲組高，但是經(jīng)過雷公藤紅素干預(yù)后其在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均受抑制，但是雷公藤紅素是否會抑制高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，本研究尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，雷公藤紅素誘導(dǎo)TGF-β1下調(diào)表達(dá)所涉及的信號途徑本研究也尚未闡明，但有研究表示雷公藤紅素可抑制組織型膠原以及I和IV型膠原的表達(dá)，從而改善組織病變[21-22]。

以上結(jié)果提示高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，炎癥相關(guān)的因子表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)ROS水平均出現(xiàn)上調(diào)，可能與心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞炎癥等病理過程具有一定的相關(guān)性。雷公藤紅素可以作為一種免疫調(diào)節(jié)劑通過對多種信號途徑參與對高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。盡管其參與的分子機(jī)制和信號途徑尚未闡明，但是雷公藤紅素仍可作為降低高血糖引起的心肌細(xì)胞病變候選藥物。