金速速，李帆帆，葉熳麗，舒曠怡，李姍姍，柳潔，江明華

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325027）

兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是兒童時期常見的一種免疫性出血性疾病，約占出血性疾病的三分之一。其發(fā)病機制迄今尚未闡明，目前認(rèn)為主要是體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞以及巨核細(xì)胞生成不足和質(zhì)量異常[1]。miRNA是一種高度保守、大小為20～25個核苷酸的非編碼小RNA[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對機體免疫細(xì)胞具有多種調(diào)控功能，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要作用，并參與自身免疫性疾病的發(fā)病與發(fā)展。目前，ITP的診斷無特異性指標(biāo)，主要根據(jù)病史、體格檢查、血小板計數(shù)、血涂片及骨髓穿刺分析來診斷[3]，屬于臨床排除性診斷。因此，本研究利用RT-qPCR對急、慢性ITP患兒的miR-144-5p、miR-668-3p、miR-134-5p進(jìn)行檢測，分析miRNAs與血小板相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系及意義，探討miRNAs在兒童ITP的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象及診斷標(biāo)準(zhǔn) 選取2016年1月至2018年1 月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診的ITP患兒25例。其中急性ITP患兒15例，慢性ITP患兒10例；男14例，女11例；年齡1～16歲。所有診斷均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。入選者需符合:①至少2次血常規(guī)檢查示血小板計數(shù)減少，血細(xì)胞形態(tài)無異常；②脾臟一般不增大；③骨髓檢查:巨核細(xì)胞增多或正常，伴成熟障礙；④須排除其他繼發(fā)性血小板減少癥。另選取15 例同期體檢的健康兒童作為對照組，排除血小板數(shù)量異常及功能異常等疾病，2組對象在年齡和性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受檢者的監(jiān)護人均知情同意。

1.2 儀器與試劑 TRIzol Reagent（美國Invitrogen Life Technologies公司）；miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR Kit、miDETECT A TrackTMmiRNA Forward Primer及miDETECT A TrackTMU6 Forward Primer（廣州銳博生物科技有限公司）；淋巴分離液（美國Sigma公司）；實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；nanodrop 2000c（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Sysmex XE5000全自動血細(xì)胞分析儀及原裝配套試劑（日本Sysmex公司）。

1.3 方法

1.3.1 血標(biāo)本的采集及處理:采集ITP患兒和對照組靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，400×g離心10 min并分離血漿。將分離的細(xì)胞沿管壁緩慢加于淋巴分離液上，2 000 r/min離心20 min后小心吸取白色云霧層細(xì)胞至另一試管中。PBS洗滌2次后加TRIzol于-80 ℃凍存。

1.3.2 總RNA的提取:利用TRIzol法提取總RNA，NanoDrop檢測RNA的濃度及純度，OD260/280在1.8～2.0者符合RT-qPCR檢測要求。

1.3.3 RT-qPCR檢測:選取miRNA芯片檢測中有差異表達(dá)（Fold change≥1.5，且P ＜0.05）的3 個miRNA（miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p）進(jìn)行qPCR分析驗證。將提取的總RNA 1 μg、5×Poly（A）Polymerase Buffer 2 μL、Poly（A）Polymerase 1 μL、RNase-free water 6 μL于冰上配制，37 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后置于冰上備用。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):反應(yīng)體系為RTase mix 4 μL、5×RTase Buffer 4 μL、miDETECT A TrackTMUni-RT Primer 2 μL、Poly（A）Tailing產(chǎn)物10 μL，以上體系均在冰上配制；擴增條件為42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min，反應(yīng)完成后所得cDNA置于冰上備用。qPCR反應(yīng):反應(yīng)體系為miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer 0.5 μL、miDETECT A TrackTMmiRNA Forward Primer 0.5 μL、2×SYBR Green Mix 10 μL、cDNA 2 μL、RNase-free water加至20 μL；擴增條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃10 s，40 cycles，熒光信號采集設(shè)在70 ℃。每個標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)以U6為內(nèi)參，將miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p的Ct值減去U6 Ct值作為△Ct實驗值，△△Ct=△Ct實驗-△Ct對照。以2-△△Ct法計算miRNA的相對表達(dá)量。

1.3.4 血小板計數(shù)及未成熟血小板分?jǐn)?shù)（immature platelet fraction，IPF%）檢測:ITP患兒及IPF%對照組的血小板計數(shù)及在Sysmex XE-5000上完成檢驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以形式表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗法進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的組間比較采用t 檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman分析，診斷試驗采用ROC曲線并計算AUC。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs在急、慢性ITP中的表達(dá) 選取miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p 3種miRNA，并利用RT-qPCR進(jìn)行檢測。其中ITP組PBMCs中的miR-144-5p和miR-668-3p較對照組表達(dá)均上調(diào)，miR-134-5p表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且急性ITP組PBMCs中的miR-144-5p、miR-668-3p表達(dá)量要高于慢性ITP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 miRNAs表達(dá)水平與血小板計數(shù)的關(guān)系 miR-144-5p（r=-0.802，P＜0.001）和miR-668-3p（r=-0.753，P ＜0.001）的相對表達(dá)量與外周血血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而miR-134-5p與外周血血小板計數(shù)無相關(guān)性（r=-0.288，P=0.161）。見圖2。

圖1 miRNAs在急慢性ITP組和對照組PBMCs中的表達(dá)

圖2 miRNAs相對表達(dá)量與外周血血小板計數(shù)的相關(guān)性分析（n=25）

2.3 miRNAs診斷ITP的ROC曲線 以對照組的miRNAs表達(dá)量為對照，繪制miR-144-5p、miR-668-3p、miR-134-5p在急、慢性ITP診斷中的ROC曲線。miR-144-5p（AUC=0.930，P=0.001）對急性ITP的診斷價值要優(yōu)于miR-668-3p和miR-134-5p，而miR-134-5p（AUC=0.895，P=0.003）對慢性ITP的診斷價值要優(yōu)于miR-144-5p和miR-668-3p?；诩s登指數(shù)，miR-144-5p和miR-134-5p的臨界值分別0.287、0.085，此時靈敏度分別為92%和90%，特異度為90%和80%。見圖3。同時，以慢性ITP的miRNAs表達(dá)量為對照，得到急性ITP miRNAs的ROC曲線，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 miRNAs診斷急、慢性ITP的ROC曲線

2.4 miRNA聯(lián)合IPF診斷ITP的ROC曲線 為了進(jìn)一步提高ITP的診斷水平，將miR-144-5p和miR-134-5p分別聯(lián)合IPF%構(gòu)建logistic回歸模型，并利用預(yù)測概率生成ROC曲線。miR-144-5p聯(lián)合IPF%對急性ITP的預(yù)測價值要優(yōu)于單個miR-144-5p指標(biāo)，當(dāng)閾值取0.562時預(yù)測的靈敏度為達(dá)93.3%，特異度可達(dá)100%。同樣的，miR-134-5p聯(lián)合IPF%對慢性ITP的預(yù)測價值也要優(yōu)于單個miR-134-5p指標(biāo)，閾值取1.934時靈敏度和特異度分別是90.0%和93.3%為最佳。見圖4。

圖4 miRNAs及miRNA聯(lián)合IPF%診斷ITP的ROC曲線

3 討論

miRNA作為一類小的調(diào)控RNA，已被證明在免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用。miR-144可通過靶向調(diào)控成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中Cadherin-11的表達(dá)，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理生理過程[5]。此外，miR-144可通過抑制RANKL mRNA的翻譯，抑制成熟免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)，提示miR-144參與免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，ITP組的miR-144-5p表達(dá)水平較對照組高，并隨著病程的發(fā)展呈下降趨勢，且與血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)。miR-144可通過靶向調(diào)控meis1表達(dá)，meis1是同源基因HoxA9的輔助因子[7]，而HoxA9是造血細(xì)胞正常分化所必需的基因，不僅影響了造血干細(xì)胞的數(shù)量，還參與造血干細(xì)胞向巨核系的分化[8]，進(jìn)而影響血小板的生成，提示miR-144-5P在ITP的發(fā)病和疾病進(jìn)展中發(fā)揮了作用。而值得注意的是，ZUO等[9]研究中發(fā)現(xiàn)成人ITP患者血漿中miR-144的表達(dá)水平較正常人低，與本研究結(jié)果相反，其原因可能是成人ITP和兒童ITP的發(fā)病機制不同，或是血漿和PBMC中的miRNA參與調(diào)控的機制不同。

以往對miR-668的研究主要集中在腫瘤、炎癥及神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等方面。本研究發(fā)現(xiàn)miR-668-3p在ITP患兒組中的表達(dá)要高于對照組，且急性ITP組高于慢性ITP組（P ＜0.05）。一項靶基因預(yù)測研究結(jié)果表明，miR-668-3p的靶基因為HoxB4[10]。而miR-668可通過調(diào)控HoxB4基因來介導(dǎo)TPO受體、Scl-1、Cyclin D1、Fog-1等的表達(dá)，從而影響巨核細(xì)胞的成熟及血小板的生成[11]。據(jù)此推斷，miR-668-3p可能參與了ITP的發(fā)病過程，且與疾病的發(fā)展存在著關(guān)聯(lián)。

ZHANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-134在川崎病中可表現(xiàn)出抗炎作用，導(dǎo)致CREB5、IL8RA、PPP1R3B、ACSL1和LRRK2表達(dá)上調(diào)，且經(jīng)過靜脈免疫球蛋白治療后呈上調(diào)趨勢。在急性缺血性腦卒中，miR-134與血清IL-6和血漿高敏感性CRP表達(dá)呈強正相關(guān)[13]，由此可知miR-134參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示miR-134 在ITP組中的表達(dá)要低于對照組，而ITP患者存在促炎癥細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子分泌失衡[14]，會激活自身反應(yīng)效應(yīng)因子B和T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而啟動血小板破壞，而血小板破壞是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，并由輔助性T細(xì)胞（Th1/Th17）釋放促炎細(xì)胞因子（IL-2/IL-17）[15]，提示miR-134可能通過炎癥反應(yīng)來介導(dǎo)血小板的破壞。此外，miR-134在A549和Calu-3細(xì)胞中過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和遷移能力[16]，miR-134可能通過細(xì)胞凋亡來介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于miR-134-5p和miR-668-3p，miR-144-5p對急性ITP的診斷價值較高，而miR-134-5p對慢性ITP的診斷價值較高。IPF是骨髓巨核細(xì)胞最先釋放入血的血小板，不僅體現(xiàn)了骨髓巨核細(xì)胞的血小板生成狀態(tài)，也能反映骨髓的血小板生成能力。研究表明[17]IPF是一種快速、廉價的血小板減少癥病因?qū)W標(biāo)志物，可作為評價骨髓血小板生成狀態(tài)的參數(shù)，也被認(rèn)為是慢性ITP發(fā)展的一個潛在的預(yù)后指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-144-5p聯(lián)合IPF%在診斷急性ITP中的靈敏度提高到93.3%，對高危人群的篩檢具有較大的意義；其特異度也提高到100%，對ITP的確診具有相當(dāng)大的價值，特別是對臨床上有些不愿意做有創(chuàng)檢查如骨髓穿刺檢查的患者診斷更有價值。同樣的，miR-134-5p聯(lián)合IPF%對慢性ITP的預(yù)測價值也要優(yōu)于單個miR-134-5p指標(biāo)，靈敏度和特異度分別可達(dá)90.0%和93.3%。

綜上所述，ITP患兒PBMCs中miR-668-3p、miR-134-5p及miR-144-5P的表達(dá)量與對照組之間存在差異，且與初發(fā)時的血小板計數(shù)存在著相關(guān)性。說明這些miRNAs參與了ITP的發(fā)生與發(fā)展，在整個疾病中參與了免疫調(diào)節(jié)等作用，但具體機制有待進(jìn)一步研究。通過ROC曲線分析，也得出miR-144-5P及miR-134-5p聯(lián)合IPF%對于ITP有較高診斷價值。這些指標(biāo)較易獲得，可以減少患兒骨髓穿刺的應(yīng)用，能將ITP檢查的不適度減至最輕，可為ITP提供輔助診斷。