林曉驥，方瑋玥，董玉青，孫妮，蘇童，楊向綢，郭文堅(jiān)，何牧卿，姚榮欣

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 血液腫瘤科，浙江 溫州 325027）

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最常見的類型，占成人NHL的30%～40%[1-2]。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、阿霉素（adriamycin，ADM）、長(zhǎng)春新堿（vincristine VCR）與強(qiáng)的松（prednisolone，Pred）組成的CHOP方案是目前被證實(shí)的治療DLBCL的最經(jīng)典治療方案，然而超過50%患者出現(xiàn)耐藥或復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[3]。眾所周知，DLBCL難治的主要原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了多藥耐藥，故研究DLBCL耐藥機(jī)制是提高DLBCL患者療效的關(guān)鍵。

miR-148b位于人染色體12q13.13上，目前研究證實(shí)miR-148b與腫瘤細(xì)胞的耐藥性關(guān)系密切。SUI等[4]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-148b可以逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)順鉑的耐藥性。WU等[5]也證實(shí)，miR-148b上調(diào)同樣可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性。然而，miR-148b在DLBCL藥物敏感性中的作用還沒有相關(guān)報(bào)道。有學(xué)者將DLBCL分為2類，一類是對(duì)CHOP方案具有較低敏感性，另一類是對(duì)CHOP方案具有較高敏感性。LIU等[6]對(duì)兩類DLBCL中蛋白進(jìn)行2D電泳聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白在低敏感組中表達(dá)水平明顯高于高敏感組，表明Ezrin與DLBCL的耐藥性存在關(guān)聯(lián)。我們采用生物信息學(xué)軟件（RAID v2.0）預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin是miR-148b的靶基因之一。所以，本研究探討miR-148b是否調(diào)控Ezrin繼而影響DLBCL細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，從而探究miR-148b/Ezrin軸成為DLBCL治療的靶向分子的潛能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 人DLBCL細(xì)胞株CRL2631購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，CTX、ADM、VCR和Pred購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，miR-148b mimic、miR-148b inhibitor以及陰性對(duì)照物由廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建合成，SYBR green和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，Ezrin單抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin單抗和MDR-1 單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)耐藥細(xì)胞株CRL2631/CHOP:根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，用CHOP方案四藥聯(lián)合（CTX、ADM、VCR和Pred的比率為80:5:0.16:11.1）把DLBCL細(xì)胞系CRL2631誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥株CRL2631/CHOP，細(xì)胞在誘導(dǎo)耐藥的初期極易死亡，選擇5 ng/mL的低濃度CHOP作為誘導(dǎo)起始濃度，逐漸提高CHOP濃度（10、20、40、80、160、320、640、1 280 ng/mL），最終獲得能夠在CHOP濃度為640 ng/mL的培養(yǎng)液中持續(xù)存活5 d并穩(wěn)定增殖的耐藥細(xì)胞株。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板（2×104細(xì)胞/孔），使細(xì)胞匯合達(dá)到70%～80%，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。將CRL2631分別轉(zhuǎn)染miR-148b inhibitor和陰性對(duì)照物，CRL2631/CHOP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-148b mimic和陰性對(duì)照物，見表1。轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，更換雙倍血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

表1 miR-148b mimic、miR-148b inhibitor和陰性對(duì)照物的序列

1.2.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入2×103個(gè)細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，與不同CHOP濃度（40、80、160和320 ng/mL）共同孵育72 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL的毒性檢測(cè)液CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，分別用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）]/對(duì)照組OD×100%，以濃度為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)。

1.2.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn):根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，將含miR-148b作用靶點(diǎn)的Ezrin 3’UTR和作用靶點(diǎn)突變的mutant-Ezrin-3’UTR連接到熒光素酶報(bào)告載體上，分別命名為野生型Ezrin-3’UTR（WT）和突變型Ezrin-3’UTR（Mut）報(bào)告質(zhì)粒（此項(xiàng)工作由南京金斯瑞生物科技公司完成）。將構(gòu)建的載體分別與miR-148b mimic和miR-148b inhibitor共轉(zhuǎn)染至CRL2631細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，分別檢測(cè)各組細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活信號(hào)，計(jì)算相對(duì)熒光值=熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入特異引物、SYBR Premix ExTaq和PCR所需試劑，于實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI 7500）上進(jìn)行反應(yīng)，制作熔解曲線判斷引物特異性，分別以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。各基因的引物序列如下:①miR-148b上游引物:5’-GCGGACACGGAGCCAGAACA-3’；miR-148b下游引物:5’-ATCACGGTCGAGGCTCAGGG-3’；②U6上游引物:5’-GCCGTTGCAGCACATATACAATAAT-3’；U6下游引物:5’-CGCTACGTTAATGCTCGTGTCAT-3’。反應(yīng)條件:95 ℃1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；終延伸68 ℃ 40 s。

1.2.6 Western blot:使用RIPA裂解液提取腫瘤組織細(xì)胞或細(xì)胞株的總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。將等量蛋白樣本以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳進(jìn)行分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)PBST清洗后，使用含5%脫脂奶粉PBST溶液室溫封閉2 h，將膜與稀釋到一定濃度的對(duì)應(yīng)一抗在4 ℃下孵育過夜，第2天將膜再與二抗室溫孵育2 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液對(duì)條帶進(jìn)行顯色，其中以β-actin作為對(duì)照蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以表示；2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，2組間不同時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)耐藥細(xì)胞株CRL2631/CHOP 采用CCK-8方法檢測(cè)CRL2631和CRL2631/CHOP細(xì)胞對(duì)不同濃度CHOP（40、80、160和320 ng/mL）的敏感性影響。結(jié)果顯示，在CHOP濃度為80 ng/mL開始，CRL2631/CHOP細(xì)胞在不同濃度的CHOP下細(xì)胞存活率均較CRL2631細(xì)胞顯著升高（P＜0.05），表明CRL2631/CHOP細(xì)胞較CRL2631細(xì)胞的藥物敏感性下降。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在CRL2631/CHOP細(xì)胞中MDR-1蛋白表達(dá)水平也顯著高于CRL2631細(xì)胞，其蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.34±0.14）和（0.35±0.08）（P＜0.001）。見圖1。

2.2 miR-148b和Ezrin在CRL2631和CRL2631/CHOP細(xì)胞株中的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)比較CRL2631和CRL2631/CHOP細(xì)胞的miR-148b mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示CRL2631/CHOP細(xì)胞的miR-148b mRNA表達(dá)水平顯著低于CRL2631細(xì)胞（P=0.001）。Western blot結(jié)果顯示，CRL2631/CHOP細(xì)胞的Ezrin蛋白表達(dá)水平顯著高于CRL2631細(xì)胞，其蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.14±0.18）和（0.45±0.06）（P＜0.05），見圖2。

圖1 CRL2631/CHOP細(xì)胞與CRL2631細(xì)胞的藥物敏感性和MDR-1表達(dá)的情況

圖2 miR-148b和Ezrin在CRL2631和CRL2631/CHOP細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 Ezrin是miR-148b靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 通過生物信息學(xué)軟件（RAID v2.0）預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin 3’UTR存在潛在的miR-148b結(jié)合位點(diǎn)（見圖3），我們推測(cè)Ezrin是miR-148b的直接靶基因。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們采用經(jīng)典的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示相對(duì)于陰性對(duì)照組，上調(diào)miR-148b的表達(dá)后，miR-148b mimic+野生型Ezrin 3’UTR載體（WT）組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR-148b mimic+突變型Ezrin 3’UTR載體（MUT）組熒光素酶活性無明顯改變。相反，在miR-148b inhibitor+WT組，下調(diào)miR-148b的表達(dá)后，熒光素酶活性較陰性對(duì)照組顯著提升（P＜0.05），而miR-148b inhibitor+MUT組的熒光素酶活性改變與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖3 Ezrin 3’ UTR與miR-148b的結(jié)合位點(diǎn)及其點(diǎn)突變

圖4 野生型/突變型Ezrin 3’ UTR載體和miR-148b mimic/inhibitor共轉(zhuǎn)染CRL2631細(xì)胞的熒光素酶活性情況

2.4 下調(diào)miR-148b的表達(dá)對(duì)CRL2631細(xì)胞Ezrin蛋白和CHOP敏感性的影響 我們分別將miR-148b inhibitor和陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染至CRL2631細(xì)胞。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-148b inhibitor組CRL2631細(xì)胞對(duì)在不同濃度CHOP下細(xì)胞存活率均較陰性對(duì)照組顯著上升（P＜0.05），表明下調(diào)miR-148b的表達(dá)使CRL2631細(xì)胞的藥物敏感性下降。Western blot結(jié)果表明，miR-148b inhibitor組MDR-1和Ezrin的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著上升，其MDR-1相對(duì)表達(dá)量分別為（1.45±0.23）和（0.31±0.09）（P＜0.001），Ezrin相對(duì)表達(dá)量分別為（1.53±0.14）和（1.01±0.11）（P＜0.05），見圖5。

圖5 下調(diào)miR-148b對(duì)CRL2631細(xì)胞的藥物敏感性、Ezrin和MDR-1蛋白表達(dá)的影響

2.5 上調(diào)miR-148b的表達(dá)對(duì)CRL2631/CHOP細(xì)胞Ezrin蛋白和CHOP敏感性的影響 我們分別將miR-148b mimic和陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染至CRL2631/CHOP細(xì)胞。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-148b mimic組CRL2631/CHOP細(xì)胞對(duì)不同濃度CHOP下細(xì)胞存活率較陰性對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），表明上調(diào)miR-148b的表達(dá)使CRL2631/CHOP細(xì)胞的藥物敏感性上升。Western blot結(jié)果表明，miR-148b mimic組MDR-1和Ezrin的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著下降，其MDR-1相對(duì)表達(dá)量分別為（0.47±0.12）和（1.52±0.24）（P ＜0.001），而Ezrin相對(duì)表達(dá)量分別為（0.62±0.16）和（1.51±0.25）（P＜0.001），見圖6。

圖6 上調(diào)miR-148b對(duì)CRL2631/CHOP細(xì)胞的藥物敏感性、Ezrin和MDR-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

DLBCL是為一組異質(zhì)性很強(qiáng)的B細(xì)胞性淋巴瘤，病理上以彌漫性分布的惡性大B淋巴細(xì)胞為特征，臨床上表現(xiàn)為侵襲性的病程[9]。隨著利妥昔單抗的引入，R-CHOP化療方案大大改善了DLBCL患者的預(yù)后，但仍有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)無效或復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。眾所周知，DLBCL難治的原因主要是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥，尤其產(chǎn)生的多藥耐藥是治療DLBCL的主要障礙。因此，研究DLBCL耐藥機(jī)制是提高DLBCL患者療效的關(guān)鍵。

miRNAs是一類長(zhǎng)度為二十幾個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學(xué)過程。有研究表明，miRNAs與DLBCL耐藥性存在關(guān)系密切。BAI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在參與調(diào)控DLBCL細(xì)胞株CRL2631對(duì)CHOP的敏感性，敲除miR-21可顯著靶向下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)水平并且通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路提高DLBCL細(xì)胞株對(duì)CHOP方案化療的敏感性。KIM等[11]也發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)miR-124可以靶向下調(diào)PDE4B蛋白，并改善DLBCL細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素的耐藥性。MARQUES等[12]證實(shí)在15 例DLBCL細(xì)胞株中對(duì)蒽環(huán)類藥物敏感性的細(xì)胞株均存在miR-34a高表達(dá)，而miR-34a可以靶向下調(diào)FOXP1從而增加DLBCL細(xì)胞對(duì)蒽環(huán)類藥物的敏感性。YUAN等[13]從56例DLBCL患者和20例健康對(duì)照組的血清中應(yīng)用RT-PCR分析，在對(duì)R-CHOP化療方案耐藥的DLBCL患者中存在血清miR-125b和miR-130a存在更高的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b和miR-130a的動(dòng)態(tài)變化可以用作監(jiān)測(cè)DLBCL患者的復(fù)發(fā)、進(jìn)展或耐藥的一個(gè)有效指標(biāo)。LEIVONEN等[14]發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)DLBCL患者中普遍存在miR-370-3p、miR-381-3p和miR-409-3p的低表達(dá)；進(jìn)一步研究結(jié)果顯示在人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-4細(xì)胞中上調(diào)miR-370-3p、miR-381-3p和miR-409-3p均可以增加細(xì)胞對(duì)利妥昔和蒽環(huán)類藥物的敏感性。而本研究發(fā)現(xiàn)耐藥株CRL2631/CHOP的miR-148b的表達(dá)量明顯低于CRL2631細(xì)胞。由此可見，miR-148b可能在與DLBCL產(chǎn)生CHOP耐藥的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

miR-148b位于人染色體12q13.13上，目前研究證實(shí)miR-148b在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多種腫瘤組織中普遍存在表達(dá)異常[15-17]。甚至多個(gè)研究表明，miR-148b與腫瘤細(xì)胞的耐藥性也存在關(guān)系密切。WANG等[18]發(fā)現(xiàn)miR-148b的表達(dá)量在放療耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者中較放療敏感的患者顯著減少。而SUI等[4]研究結(jié)果證實(shí)miR-148b的過表達(dá)可以負(fù)向調(diào)控靶基因DNMT1，從而逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549/DDP和SPC-A1/DDP對(duì)順鉑的耐藥性。HUMMEL等[19]發(fā)現(xiàn)miR-148a的上調(diào)可以增加食管腺癌和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶的敏感性。WU等[5]也證實(shí)，MiR-148b上調(diào)同樣可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性。然而，miR-148b在DLBCL耐藥中的作用還沒有相關(guān)報(bào)道。因此本研究重點(diǎn)研究miR-148b在DLBCL產(chǎn)生耐藥性過程中所發(fā)揮的作用及機(jī)制。我們采用了miRNA模擬/干擾技術(shù)和CCK-8方法研究DLBCL的CRL2631和CRL2631/CHOP細(xì)胞株進(jìn)行對(duì)CHOP的藥物敏感性試驗(yàn)。在我們的研究結(jié)果中，上調(diào)miR-148b的表達(dá)可以增加CRL2631/CHOP細(xì)胞對(duì)CHOP的敏感性，而下調(diào)miR-148b表達(dá)增加了CRL2631細(xì)胞的耐藥性。因此我們的研究進(jìn)一步證明了DLBCL對(duì)CHOP的耐藥性與miR-148b的異常表達(dá)密切相關(guān)。

目前研究證實(shí)，miRNAs通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性的與相關(guān)靶基因mRNA 3’UTR的啟動(dòng)序列相結(jié)合從而發(fā)揮腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)等多種生物學(xué)功能。因此，本研究旨在探究miR-148b在參與調(diào)控DLBCL耐藥性的靶基因。我們通過microrna.org網(wǎng)上預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Ezrin是miR-148b的靶基因之一。Ezrin蛋白是ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族成員之一，作為酪氨酸激酶的底物，Ezrin蛋白能在細(xì)胞膜蛋白與肌動(dòng)蛋白骨架之間起到橋梁的作用，參與細(xì)胞形態(tài)的形成、黏附、運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞的增殖和生存等功能。目前研究表明Ezrin蛋白與許多腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等[20-21]。甚至有研究結(jié)果顯示，Ezrin基因還參與調(diào)控腫瘤的耐藥性。LV等[22]報(bào)道，Ezrin參與了一種蛋白質(zhì)復(fù)合物EBP50組成，該復(fù)合物賦予胃癌細(xì)胞具有對(duì)5-氟尿嘧啶的化學(xué)敏感性。此外，在非小細(xì)胞肺癌中，Ezrin與EGFR的相互作用增強(qiáng)了EGFR致癌功能，增加非小細(xì)胞肺癌對(duì)埃羅替尼的耐藥性[23]。CHEN等[24]發(fā)現(xiàn)沉默Ezrin使人類肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞增加對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。PORE等[25]發(fā)現(xiàn)抑制Ezrin表達(dá)后能減少DLBCL細(xì)胞株OCI-LY-10、OCI-LY-3和SU-DHL-6細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)一步證明Ezrin抑制劑的使用顯著減少DLBCL皮下移植瘤的生長(zhǎng)。根據(jù)化療的敏感性DLBCL被分為2類:一類是對(duì)CHOP方案具有較低敏感性，另一類是對(duì)CHOP方案具有較高敏感性。LIU等[6]對(duì)兩類DLBCL中蛋白進(jìn)行2D電泳聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，有19個(gè)蛋白在兩類DLBCL中表達(dá)有2倍差異。其中Ezrin蛋白在CHOP高敏感性的DLBCL組中表達(dá)水平明顯低于CHOP低敏感的DLBCL組。MAXWELL等[26]研究發(fā)現(xiàn)在CHOP耐藥的DLBCL細(xì)胞株中存在Ezrin蛋白的高表達(dá)。由此表明Ezrin與DLBCL的耐藥性可能存在密切關(guān)聯(lián)。我們通過Western blot檢測(cè)顯示耐藥株CRL2631/CHOP細(xì)胞Ezrin的表達(dá)量明顯高于CRL2631細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步揭示Ezrin與DLBCL的耐藥性密切相關(guān)。

為了證明miR-148b和Ezrin兩者在DLBCL中存在實(shí)質(zhì)性聯(lián)系，我們采用經(jīng)典的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，將Ezrin 3’UTR熒光素酶報(bào)告載體和miR-148b inhibitor/miR-148b mimic共轉(zhuǎn)染CRL2631細(xì)胞。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b mimic與野生型Ezrin 3’UTR載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低，而miR-148b inhibitor與野生型Ezrin 3’UTR載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性顯著提升。進(jìn)一步Western blot結(jié)果顯示，在CRL2631細(xì)胞中miR-148b能調(diào)控Ezrin蛋白的表達(dá)，miR-148b的過表達(dá)可以下調(diào)Ezrin的表達(dá)，而下調(diào)miR-148b可以增加Ezrin蛋白的表達(dá)。由此證明Ezrin是miR-148b的直接靶基因。我們還發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-148b的表達(dá)不僅增加CRL2631/CHOP細(xì)胞的藥物敏感性，還下調(diào)了Ezrin蛋白的表達(dá)。另外，下調(diào)miR-148b的表達(dá)使CRL2631細(xì)胞對(duì)CHOP敏感性的同時(shí)上調(diào)了Ezrin蛋白的表達(dá)。因此，我們的研究結(jié)果證實(shí)，miR-148b通過調(diào)控Ezrin調(diào)節(jié)DLBCL對(duì)CHOP的耐藥性。

綜上所述，我們的研究顯示miR-148b在耐藥性DLBCL細(xì)胞株中呈現(xiàn)相對(duì)低表達(dá)，上調(diào)miR-148b可顯著下調(diào)Ezrin蛋白表達(dá)水平而提高DLBCL細(xì)胞株對(duì)CHOP方案化療的敏感性。這些有助于我們探索DLBCL細(xì)胞耐藥性中的關(guān)鍵作用的分子及其調(diào)控機(jī)制，而miR-148b和Ezrin有望成為DLBCL患者靶向治療的新靶點(diǎn)。