洪子璞，關開宇，王韶，徐勝男，郝燕燕，陳肖鳴

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬康寧醫(yī)院 精神衛(wèi)生研究所，浙江 溫州 325000；3.溫州市中醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325000）

微小RNA（miRNA）是通過結合靶mRNA的3'非編碼區(qū)（3’UTR）來調節(jié)基因表達[1]。miRNA通過轉錄后調控影響了大約30%人類基因的表達[2]。let-7a是let-7 miRNA家族的重要成員之一，是一個具有腫瘤抑制作用的miRNA，并在多種腫瘤疾病中表達量顯著降低，如結腸癌、乳腺癌、肺癌、生殖細胞腫瘤等[3-6]。ACVR1B也被稱為ALK4，屬于轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）受體中的IB型激活素受體。通過配體與受體結合激活下游信號介質蛋白，繼而磷酸化介質蛋白，募集其他轉錄因子共同作用調控下游靶基因的表達[7-8]。研究表明，let-7a通過調控TGF-β家族中的TGFBR3的轉錄調節(jié)血管的形成[9]。且有實驗室發(fā)現(xiàn)let-7a和ACVR1B在不同亞型的肺癌中可能存在調控關系[10]。在HEK293T細胞中l(wèi)et-7a可能通過對ACVR1B的轉錄后調控來行使功能。本研究探討ACVR1B mRNA與let-7a直接調控的潛在靶點關系，為疾病治療提供相應分子策略。

1 材料和方法

1.1 細胞株和載體 人腎胚293T（HEK293T）細胞購于中國科學院上海細胞所；pGEM-T載體、雙熒光素酶報告載體pmirGLO購于北京Promega公司。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix、Lipofectamine2 000、Lipofectamine LTX and Plus試劑購于美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；限制性內切酶PmeI和SalI、T4 DNA連接酶購于美國NEB公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay試劑盒購于美國Promega公司；QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒購于美國Agilent公司；Vinculin單克隆抗體、ACVR1B多克隆抗體購于美國Abcam公司；let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC購于廣州銳博公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購于美國Roche公司；ECL顯影液購于美國Millipore公司；山羊抗兔IgG HRP抗體購于美國Jackson公司；PCR試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、質粒提取試劑、膠回收試劑盒購于北京天根公司；RIPA蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司；引物由南京金斯瑞公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染 使用加入10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細胞至穩(wěn)定傳代2～3代，20%的濃度種植于24孔板中，let-7a模擬物（let-7a mimic）、let-7a抑制劑（let-7a inhibitor）和let-7a陰性對照組（let-7a NC）由廣州銳博公司合成，在細胞融合度達到70%時使用Lipofectamine 2 000試劑盒按照使用說明轉染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T細胞，6 h后將舊培養(yǎng)基更換為含有10% FBS、1% ECGS、無雙抗的ECM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約24 h。

1.4 雙熒光素酶報告載體的構建 依照基因組DNA提取試劑盒抽提人基因組DNA，以提取的人基因組DNA為模板進行PCR擴增:94 ℃預變性3 min，94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s循環(huán)30 次后，72 ℃最后延伸5 min。ACVR1B 3’UTR引物F:5’-CGTACGA TGGAGGCCTACCTCTCGTTTCTGCCCAGCC-3’，R:5’-GCATGC TACCTCCGGATGGAGAGCAAAGACGGGTCGG-3’，PCR產(chǎn)物進行回收純化，使用T4連接酶將pGEM-T載體和切膠回收純化的PCR產(chǎn)物進行連接，經(jīng)感受態(tài)細胞轉化擴增后構建野生型pGEMT ACVR1B 3’UTR載體，依照定點突變試劑盒進行點突變PCR反應，構建出突變型pGEMT-ACVR1B 3’UTR載體，ACVR1B 3’UTR突變引物F:5’-CGTACGATGGAGGCCTATAGCTCGTTTCTGCCCAGCC-3’，R:5’-GCATGCTACCTCCGGATATCGAGCAAAGACGGGTCG G-3’。將突變和未突變的pGEMT-ACVR1B 3’UTR載體與雙熒光素酶報告載體（pmirGLO載體）進行連接，感受態(tài)細胞轉化擴增，經(jīng)測序得到ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突變型（ACVR1B 3’UTR-MUT）重組雙熒光素酶報告載體。

1.5 雙熒光素酶報告基因活性檢測 將let-7a mimic或let-7a NC和pGEMT-ACVR1B 3’UTR-MUT或pGEMT-ACVR1B 3’UTR-WT雙熒光素酶報告載體共轉染HEK293T細胞，48 h后去除培養(yǎng)基，細胞裂解液PLB充分裂解后再加LARII，檢測螢火蟲熒光素酶的活性，加入Stop & Glo試劑，檢測海腎熒光素酶活性。結果以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值表示。

1.6 qRT-PCR檢測相關mRNA表達 根據(jù)TRIzol使用手冊，提取細胞樣本總RNA。RNA純化后，通過反轉錄試劑盒獲得cDNA。采用qRT-PCR，選取GAPDH作為內參基因比較候選基因的表達情況。結果用2-ΔΔCT法進行分析。

1.7 Western blot檢測 Western blot檢測相關蛋白表達，使用圖像分析軟件Image J對目的條帶及內參條帶進行灰度分析，再以目的條帶/內參條帶灰度值的比值用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用形式表示，2組比較用配對t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 let-7a的潛在靶基因分析 利用生物信息分析工具targetscan等預測，發(fā)現(xiàn)ACVR1B基因是let-7a的一個潛在靶基因。進一步用工具分析出ACVR1B基因的3’UTR第77-83位堿基存在let-7a的潛在結合位點，見圖1。

圖1 ACVR1B 3’UTR上let-7a潛在結合位點的預測示意圖

2.2 雙熒光素酶報告載體的構建和鑒定 構建ACVR1B mRNA 3’UTR的雙熒光素酶報告載體，并進行雙熒光素酶報告基因活性檢測實驗，測序結果比對顯示pmirGLO ACVR1B 3’UTR WT和MT型構建成功，見圖2。

圖2 pmirGLO ACVR1B 3’UTR構建和鑒定

2.3 轉染重組質粒的細胞熒光素酶活性的表達

雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示，共轉染ACVR1B 3’UTR-WT報告載體后，let-7a mimic組的熒光素酶活性比let-7a NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而共轉染ACVR1B 3’UTR-MUT報告載體后，let-7a mimic組熒光素酶活性與let-7a NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 2組報告載體中轉染不同質粒后細胞內螢火蟲海腎熒光素酶活性比值

2.4 HEK293T細胞中l(wèi)et-7a靶向調控ACVR1B的表達 HEK293T細胞熒光定量PCR顯示let-7a mimic組ACVR1B mRNA表達量較let-7a NC組和let-7a inhibitor組低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；而let-7a NC組和let-7a inhibitor組ACVR1B mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Western blot結果顯示HEK293T細胞轉染let-7a mimic后，ACVR1B的蛋白表達水平顯著低于let-7a NC組和let-7a inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；let-7a NC組和let-7a inhibitor組的ACVR1B的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4-5。

圖4 HEK293T細胞中l(wèi)et-7a負調控ACVR1B mRNA表達

3 討論

圖5 HEK293T細胞中l(wèi)et-7a負調控ACVR1B蛋白表達水平

miRNA是一種普遍存在的非編碼小RNA，能夠特異性識別并結合到靶mRNA分子的3’UTR的特定區(qū)域，通過誘導降解和抑制翻譯達到抑制靶mRNA的目的，在細胞的增殖、凋亡、分化、遷移及血管生成中起到作用[1-2]。let-7作為最先發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，參與了許多生理過程[11]。POLISENO等[12]使用miRNA芯片技術檢測發(fā)現(xiàn)，在HUVECs中有15個高表達的miRNAs與血管生成相關，let-7就是其中之一。TANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，let-7a在胃癌細胞中通過下調PKM2明顯地抑制胃癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力。另外在乳腺癌中，let-7a具有抑制癌細胞增殖、遷移的能力[14]。

ACVR1B是TGF-β受體中的I型激活素受體，參與信號的轉導。TGF-β和II型受體ACVRII使招募I型受體磷酸化激活，調控下游Smad蛋白，抑制增殖調節(jié)因子的基因轉錄，在經(jīng)典的TGFBs/SMAD信號傳導通路中發(fā)揮作用[15]。ACVR1B在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，ACVR1B在心房纖維化和心房纖顫發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[16]。SUN等[17]發(fā)現(xiàn)在HCMVEC細胞中經(jīng)過阿霉素處理后，ACVR1B表達水平升高，Smad2/3的轉錄靶點降低，血管網(wǎng)絡的形成減少受到抑制。之前的研究表明，TGF-β家族中的TGFBR3是let-7a的靶基因，且let-7a通過調控TGFBR3的轉錄調節(jié)血管的形成[9]。且有實驗室通過收集3種不同亞型的肺癌miRNA，利用富集篩查等方法發(fā)現(xiàn)let-7a和ACVR1B之間可能存在調控關系[10]。本研究利用生物信息分析工具發(fā)現(xiàn)ACVR1B mRNA是let-7a的一個潛在靶基因，為了進一步分析let-7a是否通過結合到ACVR1B基因的mRNA 3’UTR區(qū)域潛在的結合位點來調節(jié)ACVR1B基因的表達，通過構建ACVR1B野生型和ACVR1B突變型重組雙熒光素酶報告載體，分別與let-7a mimic和let-7a NC轉染HEK293T細胞，收集細胞后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各組細胞的熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)共轉染ACVR1B 3’UTR-WT報告載體組中，let-7a mimic的熒光素酶活性比let-7a NC組明顯降低，而共轉染ACVR1B 3’UTR-MUT報告載體組中，let-7a mimic熒光素酶活性與let-7a NC組差異無統(tǒng)計學意義，證明ACVR1B mRNA 3’UTR存在let-7a的特異性結合位點。為了確定let-7a是否可能靶向調控ACVR1B基因的表達，通過在HEK293T細胞中分別轉染let-7a mimic、let-7a NC和let-7a inhibitor來進一步驗證let-7a靶向抑制ACVR1B的mRNA和蛋白水平表達。這些結果初步闡述了ACVR1B可能是受let-7a直接調控的。