詹立北

摘要 目的：根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對五苓散治療糖尿病腎?。―KD）的作用機(jī)制進(jìn)行研究探討。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）對五苓散中有效成分進(jìn)行篩選及靶點預(yù)測，檢索GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫篩選DKD疾病靶點，利用韋恩圖在線平臺篩選五苓散治療DKD交集靶點，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA篩選五苓散治療DKD核心靶點，使用Cytoscape 3.7.1建立化合物-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基于DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析。結(jié)果：基于TCMSP得到五苓散的27個有效成分和62個潛在靶點，篩選獲得與DKD疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的靶點21 153個，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA篩選五苓散治療DKD核心靶點16個，GO功能富集分析得到條目99個，其中生物過程條目64個、分子功能條目24個、細(xì)胞組成條目11個，主要包括過脂質(zhì)反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號途徑、腎上腺素能受體活性、四吡咯結(jié)合、胞膜小凹等功能途徑;KEGG通路富集分析得出條目61個，主要包括NF-κB信號通路、細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、雌激素信號途徑、IL-17信號通路等通路途徑。結(jié)論：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討并驗證了五苓散治療DKD多成分、多靶點、多通路的整體調(diào)節(jié)作用特點，預(yù)測了五苓散治療DKD的潛在作用機(jī)制，以期為其活性成分研究與實驗研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);五苓散;糖尿病腎病;信號通路;靶點

Abstract Objective：To explore the mechanism of Wuling Powder（WLP）in treatment of diabetic kidney disease（DKD）based on network pharmacology.Methods：Using TCMSP to screen effective components and targets of WLP，searching GeneCards，CTD to screen targets of DKD，constructing Venn online platform to get intersection targets of WLP-DKD，selecting common targets of WLP-DKD by using CytoNCA，using Cytoscape 3.7.1 to build component-disease-target network，analyzing GO function enrichment and KEGG pathway enrichmen by David database.Results：27 effective components and 62 potential targets of WLP were obtained based on TCMSP，21 153 targets related to the occurrence and development of DKD were obtained，16 common targets of WLP-DKD were obtained by using CytoNCA.99 items were obtained by GO function enrichment analysis，including 64 biological process items，24 molecular function items and 11 cellular component items，mainly including response to lipid，G protein-coupled receptor signaling pathway，adrenergic receptor activity，tetrapyrrole binding，caveola.KEGG pathway enrichment analysis obtained 61 items，including TNF signaling pathway，IL-17 signaling pathway，NF-κB signaling pathway，apoptosis and estrogen signaling pathway signaling pathway.Conclusion：Based on network pharmacology，the overall regulatory characteristics of WLP in treatment of DKD were discussed and verified，and the potential mechanism of WLP in treatment of DKD was predicted，in order to provide scientific basis for the study of active ingredients and experimental research.

Keywords Network pharmacology; Wuling Powder; Diabetic kidney disease; Signaling pathway; Target

中圖分類號：R285;R256.5;R255.4;G350.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.004

糖尿病腎?。―iabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病病程進(jìn)展過程中最主要的慢性高血糖所致腎臟損害并發(fā)癥，也是發(fā)達(dá)國家腎臟衰竭及終末期腎臟透析的首要病因[1]。據(jù)統(tǒng)計，20% ～30%糖尿病患者將會發(fā)展為DKD，嚴(yán)重危害糖尿病患者的預(yù)后及生命質(zhì)量[2]。DKD發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，包括腎小球超濾、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、多元醇通路激活、蛋白激酶C活化、氧化應(yīng)激、遺傳因素等多種因素綜合作用所致[3]。目前臨床DKD的治療主要集中于糾正糖脂代謝紊亂、控制血壓、運動營養(yǎng)干預(yù)及降低尿蛋白等方面[4]，臨床治療上仍未取得滿意療效。因此，探析DKD發(fā)病機(jī)制尋求有效靶點早期干預(yù)以延緩DKD疾病進(jìn)展具有重要意義。而在整體觀念、辨證論治等思想指導(dǎo)下，中藥復(fù)方具有多靶點、多層次的治療特點，在DKD防治方面具有獨特優(yōu)勢及巨大潛力。目前針對五苓散治療DKD研究多為臨床病例觀察或針對個別活性單體進(jìn)行，并不能較為全面地反映五苓散治療DKD的潛在藥理作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則為從系統(tǒng)藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)層面闡述五苓散治療DKD的潛在作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，為治療DKD多靶點新藥創(chuàng)制研發(fā)與藥理作用機(jī)制研究提供了技術(shù)支撐[5]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方的有效成分-活性靶點-疾病靶點進(jìn)行綜合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使得中藥藥理學(xué)特征概括更為全面，同時也符合中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑的作用特點[6]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對五苓散治療DKD的有效成分、活性靶點、潛在機(jī)制進(jìn)行探討，以期為藥理作用研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及分析平臺 本研究所使用的數(shù)據(jù)庫及分析平臺詳見表1。

1.2 五苓散中有效成分篩選及靶點預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）對五苓散中茯苓、豬苓、澤瀉、桂枝、白術(shù)的有效成分進(jìn)行初步篩選，其中篩選條件為類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，并對篩選有效成分進(jìn)行靶點預(yù)測，利用UniProt將篩選靶蛋白名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 DKD疾病靶點的獲取 以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”作為關(guān)鍵詞，檢索并篩選GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫獲取DKD疾病靶點。

1.4 核心靶點篩選及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將五苓散治療DKD靶點進(jìn)行映射，利用韋恩圖在線平臺篩選交集靶點。利用STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺構(gòu)建五苓散治療DKD交集靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選條件設(shè)置：種屬選擇人、互作分?jǐn)?shù)值為0.4。借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA，根據(jù)DC、BC、CC、EC、NC、LAC等參數(shù)進(jìn)行拓?fù)洌Y選各指標(biāo)大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點即為核心靶點。

1.5 核心靶點的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 將篩選后的核心靶點上傳至Cytoscape 3.7.1建立化合物-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以展現(xiàn)五苓散在系統(tǒng)水平上對DKD的作用關(guān)系。利用DAVID數(shù)據(jù)庫顯示五苓散治療DKD的核心靶點蛋白在基因功能中的作用，并對五苓散治療DKD核心靶點進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，物種限定為人類，閾值設(shè)定為PValue<0.05，利用OmicShare云平臺將數(shù)據(jù)結(jié)果可視化，富集分析結(jié)果采用柱狀圖和氣泡圖形式展現(xiàn)。其中，不同顏色節(jié)點代表不同類型富集結(jié)果，而其大小與顯著程度呈正相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 五苓散中有效成分篩選和靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果 根據(jù)DL、OB參數(shù)對TCMSP進(jìn)行篩選，共得到五苓散中茯苓、豬苓、澤瀉、白術(shù)、桂枝的有效成分46個，其中有19個有效成分未預(yù)測到對應(yīng)靶點，最終獲得有效成分27個，有效成分對應(yīng)的靶標(biāo)62個，結(jié)果見表2。

2.2 DKD疾病靶點篩選結(jié)果 通過檢索GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫，檢出與DKD相關(guān)的靶點分別為10 661個、18 750個，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)靶點后共納入21 153個與DKD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點。

2.3 核心靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 利用韋恩圖在線平臺將21 153個DKD疾病靶點與62個五苓散有效成分作用靶點映射以繪制韋恩圖，即五苓散治療DKD的交集靶點，結(jié)果見圖1，其中藍(lán)色代表GeneCards疾病靶點，黃色代表CTD疾病靶點，綠色代表五苓散有效成分作用靶點，由此可篩選得到五苓散治療DKD交集靶點60個。在STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺輸入60個交集靶點，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA，限定參數(shù)（DC≥8，BC≥20，CC≥0.239，EC≥0.09，NC≥5.65，LAC≥3.75）拓?fù)浜Y選后獲得16個核心靶點，再次導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖2。五苓散治療DKD的核心靶點條形圖可篩選出核心靶點，即鄰接節(jié)點數(shù)目越多表示成為核心靶點的概率越大，結(jié)果見圖3。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，共有16個節(jié)點，63條邊，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點代表靶點蛋白，線條代表靶點蛋白之間的聯(lián)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)程度越大。最終篩選得到五苓散治療DKD核心靶點16個，分別為ACHE，ADRA1A，ADRA1B，AR，CASP3，CAT，CHRM1，ESR1，F(xiàn)2，ICAM1，JUN，NOS3，NR3C1，PTGS2，RELA，SLC6A4。

2.4 化合物-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 利用Cytoscape 3.7.1將16個核心靶點、14個有效成分、中藥（茯苓、豬苓、澤瀉、白術(shù)、桂枝）和疾?。―KD）導(dǎo)入以構(gòu)建化合物-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共包含30個節(jié)點（16個核心靶點節(jié)點以及14個有效成分節(jié)點）以及33條邊，其中綠色長方形節(jié)點代表有效成分，紫色橢圓形節(jié)點代表靶點。在有效成分方面，MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000049（3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮）作用靶點均為7個，MOL004576（二氫槲皮素）作用靶點為4個。在核心靶點方面，7個核心靶點能與≥2個有效成分相連接，其中PTGS2能與9個有效成分相連接，NR3C1能與4個有效成分相連接。由此可見，網(wǎng)絡(luò)中存在一個有效成分與多個核心靶點的相互作用，同時也存在不同有效成分相互作用于同一核心靶點，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點治療DKD的作用機(jī)制。

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 利用DAVID 6.8對16個核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析，共得到GO條目99個，其中功能（Molecular Function，MF）條目24個、細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）條目11個、分子生物過程（Biological Process，BP）條目64個，主要富集結(jié)果見圖5，各自GO功能富集分析結(jié)果見圖6～8。GO功能富集分析結(jié)果顯示：BP主要涉及有細(xì)胞增殖、脂質(zhì)反應(yīng)、血管直徑及容量調(diào)節(jié)、血管收縮、有機(jī)環(huán)狀化合物及含氧化合物反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號途徑等方面;MF主要涉及蛋白質(zhì)同源二聚化及異源二聚化活性，腎上腺素能受體活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、四吡咯結(jié)合等方面;CC主要涉及等膜筏、膜微域、胞膜小凹、突觸前后膜等方面。

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（2020-01-09收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）