黃凱悅， 劉敏燕， 陳 婷， 陸昌瑞， 趙 越， 邵志宇， 張?jiān)讫?/p>

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院， 上海 201620)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約170萬新發(fā)乳腺癌病例，但其預(yù)防環(huán)境進(jìn)展緩慢[1-2]。目前，癌癥臨床療法包括化療、放療、手術(shù)、免疫治療和其他方法[3]，個(gè)性化治療也在不斷推進(jìn)，以減小副作用，提高總體生存率[4]。在乳腺癌治療中非手術(shù)療法也很重要，非手術(shù)抗癌方法主要有化療和放療，都會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激來殺死癌細(xì)胞。雖然放/化療會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成傷害[5]，但仍是癌癥治療的標(biāo)準(zhǔn)方法[6-7]。近年來，科學(xué)界和制藥行業(yè)在乳腺癌研究方面取得了顯著進(jìn)展，幾乎所有類型乳腺癌治療都已進(jìn)入靶向治療階段[8]，化學(xué)合成藥物通常是癌癥化療的唯一選擇[9-10]，因而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)且低毒的靶向治療藥物是患者迫切需要的[11]。抗腫瘤藥物按來源可分為化學(xué)合成藥物(如烷化劑、抗代謝藥等)或天然藥物(如紫杉醇、喜樹堿等)[12-13]。天然抗瘤藥物開發(fā)最受關(guān)注，因其來源豐富，高效、低毒且副作用小[12]。

莽吉柿(Garciniamangostana)即山竹，主要分布于東南亞，屬于藤黃科[13]。 其果皮含有大量的粗纖維，果膠和多酚。研究表明，山竹果皮提取物具有抗癌作用[14]，以及抗病毒和抗氧化[15-16]作用。在東南亞，這種提取物被用作治療多種疾病的藥物，現(xiàn)已有數(shù)百年的歷史[17]。另外，山竹果皮提取物中存在芒果醚及4種已知氧雜蒽酮(2-5)[13]，并且芒果醚最早被泰國(guó)科學(xué)家在雷公藤植物中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)其對(duì)4類腫瘤細(xì)胞存在毒性：MCF-7(人乳腺癌)，KB(人口腔癌)，HeLa(人宮頸癌)和HT-29(人結(jié)腸癌)。芒果醚全稱為3,4-dihydro-5,9-dihydroxy-8-methoxy-7-(3-methoxy-3-methylbutyl)-2,2-dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-b]xanthen-6-one，分子式為C25H30O7，是一種淡黃色針狀晶體，其結(jié)構(gòu)式見圖1[13]。

圖1 芒果醚結(jié)構(gòu)式

本課題組從山竹果皮內(nèi)提純了一種芒果醚，并以吉西他濱(Gemcitabine，簡(jiǎn)稱Gem)作為陽性對(duì)照24 h給藥處理乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)其具有促發(fā)生細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞遷移的作用，并探析其分子機(jī)制，以期對(duì)乳腺癌治療藥物開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

芒果醚由本課題組提純獲取，吉西他濱由邵志宇課題組提供。MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2細(xì)胞均購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(上海)；1×DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Cellmax公司、胰酶酚紅-EDTA消化液、100×雙抗(青霉素&鏈霉素混合溶液)及胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于Costar公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于MESGEN公司；CCK-8試劑盒和DPBS緩沖液購(gòu)于上海碧云天公司；Hoechst 33342染液購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；TEMED、預(yù)染Marker、脫脂奶粉、Tris base、甘氨酸、Tween 20、氯化鈉和丙烯酰胺均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇、無水乙醇均購(gòu)于上海云麗經(jīng)貿(mào)有限公司；二抗(羊抗兔)、Actin購(gòu)于北京聚合美生物科技公司；一抗(Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Precaspase-9)購(gòu)于CST公司；BSA購(gòu)于BIOSHARP公司。

人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SUM1315MO2和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10均在含有10%的胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的1×DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并放置于5% CO2體積分?jǐn)?shù)的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并每隔12 h在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

分別取出適量芒果醚和吉西他濱粉末溶于DMSO藥物原液。再將芒果醚藥物原液稀釋配成16、20、24、28和32 μmol/L，將Gem藥物原液稀釋配成20、40和60 μmol/L。不加任何藥物的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照，濃度為0 μmol/L。

1.2 CCK-8細(xì)胞增殖和毒性實(shí)驗(yàn)

利用CCK-8試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明進(jìn)行操作來檢測(cè)芒果醚和Gem兩種藥物對(duì)MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖和毒性情況。

1.3 Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)

使用Hoechst 33342染液檢測(cè) Gem和芒果醚給藥 24 h后MCF-7 細(xì)胞的凋亡情況。

1.4 MCF-7的細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

利用槍頭在培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞的6 cm皿底沿直徑線劃1道痕跡，分別培養(yǎng)24 h后，取出細(xì)胞板，在倒置熒光顯微鏡下觀察芒果醚、Gem給藥24 h的劃痕面積變化情況并拍照保存。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot，簡(jiǎn)稱WB)檢測(cè)方法：芒果醚、Gem 給藥 MCF-7細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞裂解制樣，恒壓(190 V，45 min)電泳結(jié)束后，濕法轉(zhuǎn)膜(100 V，80 min)，孵育一抗、二抗后拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果醚具有顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)活性

不同濃度的Gem和芒果醚24 h給藥處理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等4種細(xì)胞后，評(píng)估乳腺癌細(xì)胞的生存情況。如圖2(a)所示，芒果醚以劑量依賴性方式顯著降低了MCF-7細(xì)胞存活率，但是給藥濃度超過24 μmol/L時(shí)，細(xì)胞生存率基本沒有變化，因而選取16、20和24 μmol/L等3個(gè)濃度進(jìn)行研究。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定MCF-7細(xì)胞給藥24 h的IC50為20 μmol/L。如圖2(b)所示，當(dāng)Gem以60 μmol/L的濃度作用24 h時(shí)，細(xì)胞存活率約為50%，即 Gem的IC50值為24 h的60 μmol/L。圖2還表明，芒果醚對(duì)MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3種細(xì)胞的毒性很低，Gem對(duì)MCF-7、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3種細(xì)胞都有活性抑制，對(duì)MCF-10細(xì)胞影響很低。本實(shí)驗(yàn)主要探究芒果醚的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只選擇MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象。

2.2 芒果醚與Gem可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

圖3所示為芒果醚給藥處理MCF-7細(xì)胞可誘發(fā)產(chǎn)生凋亡小體，并存在劑量依賴現(xiàn)象，即隨著給藥濃度升高，芒果醚對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用隨之加強(qiáng)，凋亡小體增多。不同的是，在相同給藥時(shí)間內(nèi)芒果醚作用后誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡小體相較于Gem來說數(shù)量偏多，從而也反映了在較低給藥濃度下芒果醚對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用更強(qiáng)。

芒果醚和Gem以不同濃度給藥處理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231、SUM1315MO2 這4種細(xì)胞24 h后的CCK-8檢測(cè)結(jié)果，未給藥組設(shè)為對(duì)照。(a)芒果醚給藥4種細(xì)胞，濃度依次為0、16、20、24、28和32 μmol/L；(b)Gem給藥4種細(xì)胞，濃度依次為0、20、40和60 μmol/L(***P< 0.0001、**P<0.001、*P<0.05)

(a)和(e)對(duì)照組，給藥濃度為0；(b)～(d)芒果醚給藥MCF-7，濃度依次為16、20和24 μmol/L；(f)～(h)Gem給藥MCF-7，濃度依次為20、40和60 μmol/L

2.3 芒果醚可促發(fā)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的凋亡途徑

根據(jù)之前得到的IC50數(shù)值及凋亡小體染色結(jié)果，可針對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。Bcl-2、Precaspase 9、Bax和Cytochrome C這4種蛋白因子是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過檢測(cè)給藥前后這4種蛋白因子的變化情況對(duì)芒果醚可致MCF-7細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制做初步判斷。圖4顯示芒果醚和Gem都可以下調(diào)Bcl-2和Precaspase 9的表達(dá)，上調(diào)Bax和Cytochrome C蛋白表達(dá)，并且以劑量依賴性方式發(fā)生顯著變化。這些檢測(cè)結(jié)果說明Gem和芒果醚致死MCF-7細(xì)胞與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路息息相關(guān)。

(a)芒果醚給藥MCF-7，濃度依次為0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem給藥MCF-7，濃度依次為0、20、40和60 μmol/L。未給藥組設(shè)為對(duì)照；給藥時(shí)間為24 h

(a)芒果醚作用MCF-7細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)，給藥濃度為0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem作用MCF-7細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)，給藥濃度為0、20、40和60 μmol/L；(c)兩種化合物給藥24 h后的細(xì)胞劃痕愈合面積定量分析圖。未給藥組設(shè)為對(duì)照

2.4 芒果醚可抑制MCF-7細(xì)胞遷移

如圖5(a)和圖5(b)所示，未給藥組的劃痕處的傷口愈合面積明顯大于其他給藥組，各給藥組的傷口愈合面積隨著時(shí)間和給藥濃度增加而出現(xiàn)劃痕處細(xì)胞遷移量減少的現(xiàn)象，表現(xiàn)為愈合面積減小。如圖5(c)所示，對(duì)給藥前后劃痕面積變化的定量分析中發(fā)現(xiàn)，24 h后未給藥組劃痕面積很小，傷口愈合面積幾乎覆蓋了劃痕面積，而給藥組24 h后的劃痕面積就趨于給藥之前的初始劃痕面積。因此，芒果醚與Gem給藥細(xì)胞的劃痕面積變化，表明兩種藥物都可以抑制MCF-7細(xì)胞遷移。

3 討論與結(jié)論

尋找新的有前景的癌癥治療藥物已成為熱點(diǎn)問題[18]。自然界物種豐富且環(huán)境復(fù)雜，是潛在活性天然藥物的寶庫，目前這些天然資源已為全球數(shù)百萬人提供著一線藥物[19-22]。靶向藥物成為乳腺癌化療藥物的首選，如紫杉醇及其半合成衍生物等已在臨床治療中取得了顯著效果[23]。一般來說，天然藥物作為乳腺癌臨床治療藥物仍存在很大不確定性。這些因素包括如何提高生物利用度、增強(qiáng)活性、構(gòu)建靶向給藥系統(tǒng)等[24]。這些情況需要通過不同專業(yè)科學(xué)家共同努力來解決。

本研究對(duì)從山竹果實(shí)內(nèi)提取的一種芒果醚進(jìn)行了抗腫瘤活性的分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有較好的增殖抑制、促發(fā)凋亡和抑制細(xì)胞遷移的效果。山竹“芒果醚”給藥處理MCF-7細(xì)胞24 h后，IC50值為20 μmol/L，出現(xiàn)凋亡小體，具有劑量和時(shí)間依賴現(xiàn)象。同時(shí)，芒果醚可促發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)，WB檢測(cè)結(jié)果顯示，Bcl-2劑量依賴性下調(diào)，而Bax上調(diào)，Cytochrome C顯著上調(diào)，Precaspase-9也明顯下調(diào)，這表明其可通過促發(fā)線粒體依賴性凋亡途徑而抑制了MCF-7增殖。另外，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芒果醚可有效減弱MCF-7細(xì)胞遷移。

本研究明確了山竹“芒果醚”可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、促發(fā)凋亡和抑制遷移等現(xiàn)象，但其分子機(jī)制仍需要更為深入的探討，本課題正積極開展這項(xiàng)工作。另外，本研究顯示，芒果醚對(duì)MCF-7細(xì)胞(ER+/PR+/P53+/-)作用明顯，但是對(duì)MDA-MB-231(ER-/PR-/HER2-)和SUM1315MO2(ER-/PR-/TP53+)細(xì)胞無明顯作用，表明芒果醚抑制乳腺癌具有特異性，但仍不明確，有待進(jìn)一步探析。了解芒果醚藥物靶點(diǎn)和作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)芒果醚潛在抗乳腺癌意義重大。