王 欣， 李曉寧， 陳佳賢， 陳 貞， 肖君華， 李 凱， 周宇荀

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所, 上海 201620)

人類和小鼠的miR-29家族由miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2和miR-29c組成[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，miR-29家族在神經(jīng)元分化、突觸生長及記憶的形成等相關(guān)生理過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，是基因組DNA在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為5′端甲基胞嘧啶(mC)的過程[3]。基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是抑制基因表達(dá)的重要途徑。與DNA甲基化密切相關(guān)的基因有以下兩類：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3A/B和DNA羥甲基化酶基因TET1/2/3，其中DNMT3A/B主要介導(dǎo)CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化[4]，而TET蛋白可使5-甲基胞嘧啶(5-mC)羥化生成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，啟動(dòng)DNA去甲基化過程[5]。已有研究[6]表明，DNMT3A/B和TET1/2/3均為miR-29的靶基因，Takada等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-29b可通過靶向Dnmt3a/b進(jìn)而調(diào)控小鼠原始生殖細(xì)胞PGCs中基因組DNA的甲基化。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-29可直接靶向Tet1/2/3的3'UTR，實(shí)現(xiàn)調(diào)控5-mC和5-hmC的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳修飾。

促性腺激素釋放激素(GnRH)是由下丘腦分泌的一種十肽激素，是參與下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控的關(guān)鍵激素[9-10]。Kim等[11]將熒光素酶報(bào)告基因置于GnRH啟動(dòng)子下游構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)攜帶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到-1 005 bp的啟動(dòng)子區(qū)域的小鼠卵巢中熒光素酶活性最高。Kurian等[12]則在研究恒河猴GnRH神經(jīng)元發(fā)育過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，包括GnRH基因在內(nèi)的很多基因都存在明顯的CpG島低甲基化現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠下丘腦來源的神經(jīng)元的GT1-7細(xì)胞中敲除miR-29可使GnRH的表達(dá)量提高2倍左右[13]，而miR-29通過靶向Dnmt3a/b和Tet1/2/3影響GnRH啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平是其參與調(diào)控GnRH表達(dá)的可能機(jī)制之一。為了解該調(diào)控機(jī)制是否存在，選取GnRH啟動(dòng)子上游-1005 ～ +1區(qū)域作為目的區(qū)段，利用二代測序技術(shù)檢測GnRH啟動(dòng)子區(qū)域的7個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度，并利用CRISPR-dCas9技術(shù)在甲基化水平差異明顯的位點(diǎn)CpG6分別富集Dnmt3a和Tet1酶，研究與miR-29相關(guān)的這兩種酶對(duì)該CpG6位點(diǎn)和其他CpG位點(diǎn)甲基化程度的影響，以及該影響與GnRH表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

CRISPR-dCas9載體、去除Cas9蛋白的42230-EGFP載體、鼠源GT1-7及miR-29敲除GT1-7細(xì)胞、Hepa1c1c-7細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、PBS(上海元象生物科技有限公司)；胎牛血清FBS、Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；LipofectamineTM3000(Invitrogen，美國)；AgeI-HF、BbSI核酸內(nèi)切酶(New England Biolabs，美國)；DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)；一步定向克隆試劑盒、Novostart?SYBR qPCR SuperMix Plus(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)；MPXTaqDNA聚合酶(蘇州新海生物股份有限公司)；PCR引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。

NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)；PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD，美國)；倒置相差熒顯微鏡(OLYMPUS，日本)；7500型ABI Real-Time PCR System(Applied Biosystems Inc，美國)；Partec CyFlow?Space流式細(xì)胞儀(Partec，德國)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及重亞硫酸鹽修飾

按照基因組DNA抽提說明書提取細(xì)胞DNA，用NanoDrop紫外分光光度計(jì)測定濃度后保存至-20 ℃。根據(jù)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說明書，對(duì)已獲取的每個(gè)基因組DNA樣本各取1 μg進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化程序：95 ℃ 10 min，64 ℃ 60 min。

1.2.2 BSP法擴(kuò)增GnRH啟動(dòng)子目的區(qū)段

利用Methyl Primer軟件和Oligo 7軟件在線設(shè)計(jì)BSP引物，分成5個(gè)區(qū)段(M1、M2、M3、M4、M5)PCR擴(kuò)增GnRH基因啟動(dòng)子-1005～+1的7個(gè)CpG位點(diǎn)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 15 min；98 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min。擴(kuò)增區(qū)段詳見圖1，BSP引物序列見表1。

圖1 BSP法擴(kuò)增GnRH啟動(dòng)子目的區(qū)段

表1 BSP引物

1.2.3 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1過表達(dá)載體的構(gòu)建

利用NCBI網(wǎng)站找到鼠源Dnmt3a的編碼區(qū)序列(CDS)并設(shè)計(jì)含有同源臂的引物序列，Trizol法提取小鼠GT1-7細(xì)胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，PCR獲得含有同源臂的Dnmt3a的CDS序列，利用同源重組的方法構(gòu)建重組載體CRISPR-dCas9-Dnmt3a(dCas9-Dnmt3a)。同樣獲取Tet1的催化結(jié)構(gòu)域序列(CD)構(gòu)建Tet1過表達(dá)載體CRISPR-dCas9-Tet1(dCas9-Tet1)，重組載體示意圖及引物序列見圖2和表2。載體送上海生工生物有限公司測序鑒定后使用。

圖2 CRISPR-dCas9-Dnmt3a(a)/Tet1(b)過表達(dá)載體的構(gòu)建

表2 同源重組PCR引物序列

1.2.4 42230-sgRNA-EGFP載體的構(gòu)建

針對(duì)GnRH啟動(dòng)子區(qū)的CpG6位點(diǎn)和CpG2位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)sgRNA(sgRNA-CpG6、sgRNA-CpG2)，針對(duì)Sp1基因的sgRNA-Sp1用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照，將sgRNA構(gòu)建到42230-EGFP載體上獲得重組載體，sgRNA設(shè)計(jì)及引物序列詳情見圖3和表3。載體送上海生工生物有限公司測序鑒定后使用。

sgRNA-Sp1由本實(shí)驗(yàn)室保存提供

1.2.5 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1載體和42230-sgRNA-EGFP載體的共轉(zhuǎn)染

按照Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將成功構(gòu)建好的CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1質(zhì)粒和42230-sgRNA-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至6孔板培養(yǎng)的miR-29KO-GT1-7和GT1-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染方案如下：每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒總量2 μg，miR-29KO-GT1-7組(實(shí)驗(yàn)組共4個(gè))：dCas9-Dnmt3aonly；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-Sp1；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG2；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6；miR-29KO-GT1-7對(duì)照組：未經(jīng)處理的野生型miR-29KO-GT1-7細(xì)胞。GT1-7組(共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組)：dCas9-Tet1 only；dCas9-Tet1+sgRNA-Sp1；dCas9-Tet1+sgRNA-CpG2；dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6；GT1-7對(duì)照組：未經(jīng)處理的野生型GT1-7細(xì)胞。各組培養(yǎng)24 h后觀察綠色熒光，48 h后收集細(xì)胞用于流式分選。

1.2.6 流式細(xì)胞分選技術(shù)富集陽性細(xì)胞

將6孔板中培養(yǎng)的各組細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后用500 μL培養(yǎng)基重懸，利用Sysmex CyFlow流式細(xì)胞儀上機(jī)分選，分選得到的各組陽性熒光細(xì)胞一半細(xì)胞量用于二代測序檢測位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，另一半則用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GnRH表達(dá)變化。

1.2.7 二代測序數(shù)據(jù)分析

為確定每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，將測序平臺(tái)收集的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA測序讀段與參考區(qū)段原始序列比對(duì)，每個(gè)位點(diǎn)C的總數(shù)(甲基化C)和T的總數(shù)(未發(fā)生甲基化C)的比例則反映各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平(%)，即methylation ration of each CpG site = C/(C+T)。

1.2.8 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Trizol法提取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞總RNA，每組取1 μg經(jīng)DNA酶處理的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。cDNA稀釋5倍后用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板，利用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果采用2-ΔΔCt值分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與作圖

實(shí)驗(yàn)中關(guān)于基因表達(dá)量的檢測均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析和繪圖，各組之間比較采用t-test，其中P<0.05(*)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-29敲除對(duì)GnRH、Dnmt3a及Tet1基因表達(dá)量的影響

GnRH在GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7細(xì)胞中的表達(dá)差異見圖4(a)。其中，在Hepa1c1c-7中，GnRH表達(dá)量過低(P<0.001)，表明該基因的表達(dá)具有組織特異性，miR-29KO-GT1-7細(xì)胞中GnRH表達(dá)量較GT1-7中表達(dá)顯著上升(P<0.05)。圖4(b)中，miR-29KO-GT1-7細(xì)胞中Dnmt3a、Tet1的表達(dá)相比于GT1-7細(xì)胞顯著增加(Dnmt3a：P<0.001；Tet1：P<0.01)。

* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001

2.2 二代測序數(shù)據(jù)分析GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化程度

GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子目的區(qū)段的7個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度詳見表3。結(jié)果顯示，miR-29KO-GT1-7的CpG6位點(diǎn)甲基化程度最低，為51.28%，較其他組下降約20%～40%。

表3 GT1-7、miR-29KO-GT1-7和Hepa1c1c-7細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子區(qū)域甲基化結(jié)果

2.3 二代測序檢測流式分選的miR-29KO-GT1-7及GT1-7實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞中的GnRH啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度

miR-29KO-GT1-7及GT1-7實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)詳見表4和表5。表4的miR-29KO-GT1-7實(shí)驗(yàn)組結(jié)果顯示，載體轉(zhuǎn)染后，各CpG位點(diǎn)都發(fā)生不同程度的改變，其中，變化最大的為dcas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6組的CpG6位點(diǎn)，較其他組增加約10%～20%。同樣在表5的GT1-7實(shí)驗(yàn)組中，變化最大的是dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6組的CpG6位點(diǎn)，較其他組下降約10%～20%。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測流式分選的miR-29KO-GT1-7及GT1-7實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞中的GnRH表達(dá)變化

圖5(a)所示，與對(duì)照組相比，miR-29KO-GT1-7實(shí)驗(yàn)組中GnRH的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的變化，其中dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6組，GnRH變化最為顯著，下降約40%(P<0.01)。同樣在圖5(b)中對(duì)比發(fā)現(xiàn)，GnRH表達(dá)有不同程度的上升，其中dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6組變化較大，上升約50%(P<0.05)。

表4 miR-29KO-GT1-7實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化程度

表5 GT1-7實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞中GnRH啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化程度

*P<0.05；** P<0.01；***P<0.001

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在GT1-7細(xì)胞中敲除miR-29可導(dǎo)致GnRH表達(dá)上升，轉(zhuǎn)錄激活因子Tbx21作為miR-29的靶基因，可通過直接與GnRH啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子Dlx1的表達(dá)間接影響GnRH的表達(dá)[13]。然而，在GT1-7細(xì)胞中過表達(dá)Tbx21并不能完全達(dá)到miR-29敲除導(dǎo)致的GnRH表達(dá)提高的程度，這提示除了Tbx21以外，miR-29可能還通過其他的靶基因影響GnRH的表達(dá)，比如可能通過靶向Dnmt3a/b、Tet1/2/3等DNA甲基化修飾酶調(diào)節(jié)GnRH的表達(dá)[14]。

DNA甲基化通常發(fā)生在富含CpG島的啟動(dòng)子區(qū)域，細(xì)胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平由DNMT3A/B酶介導(dǎo)的甲基化和TET酶介導(dǎo)的去甲基化協(xié)同調(diào)控[15]。為了解miR-29是否能通過上述兩類酶調(diào)控GnRH啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化程度影響GnRH的表達(dá)，我們?cè)诩谆町惷黠@的CpG6位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)sgRNA，利用CRISPR-dCas9技術(shù)特異性地在該位點(diǎn)分別富集miR-29的靶蛋白DNMT3A和Tet1后發(fā)現(xiàn)，這兩種酶可引起CpG6位點(diǎn)甲基化程度顯著上升或下降，同時(shí)GnRH的表達(dá)量也同步降低(P<0.01)或增加(P<0.05)。Aleksandar等[16]利用CRISPR-dCas9技術(shù)在IL6ST和BACH2基因的多個(gè)CpG島區(qū)域富集Dnmt3a后發(fā)現(xiàn)，與單個(gè)sgRNA轉(zhuǎn)染相比，多個(gè)sgRNA的共轉(zhuǎn)染會(huì)導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平顯著增加并抑制基因的表達(dá)。Choudhury等[17]同樣利用該技術(shù)在BRCA1啟動(dòng)子多個(gè)CpG島附近富集Tet1，使其啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化，促進(jìn)了基因表達(dá)。我們?cè)谄渌腃pG位點(diǎn)之一進(jìn)行同樣的富集，并未觀察到GnRH表達(dá)量的明顯變化。Shimada等[18]在研究發(fā)作性睡病調(diào)控機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，CCR3基因中單個(gè)位點(diǎn)甲基化是引起該病發(fā)生的候選區(qū)域之一，這表明單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化的改變也可影響基因的表達(dá)。因此，推測在GnRH基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)，CpG6位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)相對(duì)于其他位點(diǎn)而言是一個(gè)更為敏感的調(diào)控位點(diǎn)。另外，該位點(diǎn)所處序列Tm值較低，在復(fù)制過程中可能更容易發(fā)生解鏈、結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和其他的DNA修飾酶等，更為精確的分子機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：miR-29可能通過其靶基因Dnmt3a和Tet1影響GnRH啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的甲基化程度，而這也是其參與調(diào)控GnRH表達(dá)的分子機(jī)制之一；特定CpG位點(diǎn)甲基化水平的改變會(huì)顯著影響GnRH基因的表達(dá)，這為后續(xù)解析表觀遺傳修飾調(diào)控性發(fā)育的精細(xì)機(jī)制提供了新的依據(jù)。