杜 靜， 周 艷， 納 璐， 林曉晨， 胡曉青， 汪 藝， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650118)

輪狀病毒(Rotavirus, RV)是一種雙鏈RNA病毒，常感染嬰幼兒進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年感染輪狀病毒住院治療的嬰幼兒占35%至50%，導(dǎo)致全球約20萬嬰幼兒死亡[1]。輪狀病毒感染引起的腹瀉尚無特效藥治療。因此，研究輪狀病毒致病機(jī)理具有重要意義。

輪狀病毒屬于呼腸病毒科，是一種無包膜的二十面體形狀病毒，是一種由11個不連續(xù)節(jié)段組成的雙鏈RNA病毒，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-4、6、7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-6)[2-5]。輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白3(VP3)，由長度為2 362個堿基的輪狀病毒基因4(Rotavirus complete gene 4)編碼，包含776個氨基酸，VP3蛋白分子大小98 ku[6]。VP3可以特異性結(jié)合GTP，是一種鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶[7]。RNA病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種轉(zhuǎn)錄策略，其中許多涉及通過病毒加帽酶的活性向病毒mRNA的5′末端添加帽結(jié)構(gòu)。添加甲基化帽結(jié)構(gòu)可以幫助穩(wěn)定病毒mRNA，增強(qiáng)其翻譯，并防止細(xì)胞先天免疫傳感器檢測它們。輪狀病毒VP3蛋白可以給病毒mRNA加帽，有助于對抗細(xì)胞固有的抗病毒防御[8]。除了其加帽活性外，VP3還可以作為毒力決定因子起作用。據(jù)報道，VP3的C末端結(jié)構(gòu)域通過切割2′-5′-寡腺苷酸(2-5A)來拮抗干擾素誘導(dǎo)的寡腺苷酸合成酶(OAS)-RNase L途徑。VP3可能通過拮抗RNase L或通過甲基化2′-O位置的病毒RNA來促進(jìn)毒力[9-10]。因此，本文構(gòu)建pEGPF-N2-VP3真核表達(dá)載體，并初步探討VP3對RV復(fù)制的影響，旨在為后續(xù)更加深入地探究VP3的功能及在輪狀病毒復(fù)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌(DH-5α)；非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞系(MA104);輪狀病毒 ZTR-68株 (G1P[8])、pEGFP-N2真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器

MEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；新生牛血清(北京民海生物科技有限公司)；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒(Omega 公司)；病毒核酸提取試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶和T4連接酶(Thermo Fisher Scientific公司);One-Step RT-PCR 試劑盒(大連寶生物有限公司)；one-step probe qRT-PCR試劑盒(北京TransGen Biotech公司)TRizol 和 Lipofectamine3000(Invitrogen 公司);鼠抗 β-actin 抗體(Origene公司);山羊抗RV(G1)抗體(本實(shí)驗(yàn)室保存);兔抗VP3(金斯瑞生物科技有限公司合成)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(美國KPL 公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(美國Signalway Antibody公司)；Cy-3標(biāo)記的驢抗山羊抗體(美國Jackson Immune Research公司)；引物(北京碩擎科技有限公司合成)；探針(上海捷瑞公司合成);熒光定量PCR 儀CF96(Bio-Rad公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的RV G1P[8]型VP3及載體pEGFP-N2的序列設(shè)計(jì)引物。P1:5′-CGGAATTCCGACCATGAAAGTATTAGCT-3′;P2:5′-GCGTCGACTCAC TCAGACATATCAAAT-3′(下劃線部分分別為EcoR I和SalI酶切位點(diǎn))，引物由北京碩擎科技有限公司合成。

1.4 RV-VP3基因序列擴(kuò)增

用病毒核酸提取試劑盒提取MA104細(xì)胞內(nèi)RV總RNA。使用TaKaRa一步法試劑盒通過RT-PCR擴(kuò)增出VP3基因。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共35次循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收目的片段并測序鑒定。

1.5 重組真核表達(dá)載體pEGFP-N2-VP3的構(gòu)建

將pEGFP-N2和VP3基因序列分別用EcoR I 和SalI進(jìn)行雙酶切。10 μL酶切體系：VP3基因序列/ pEGPF-N2空載質(zhì)粒1 μg，EcoR I 和SalI各1 μL，10×buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃水浴15 min，1%瓊脂糖電泳后切膠，用膠回收試劑和回收純化VP3目的條帶和pEGPF-N2載體，進(jìn)行連接。20 μL連接體系：酶切目的片段(VP3)7 μL，酶切載體(pEGPF-N2)1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，buffer 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：16 ℃水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將菌液涂布于含0.1% kan+的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過夜。次日挑取單克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基(含0.1% kan+)擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取陽性克隆質(zhì)粒。

1.6 重組質(zhì)粒pEGPF-N2-VP3的初步鑒定

重組質(zhì)粒用雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送碩擎測序，測序結(jié)果與VP3進(jìn)行BLAST比對。

1.7 重組質(zhì)粒pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞及其表達(dá)

轉(zhuǎn)染前一天接種合適密度的MA104細(xì)胞，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)約24 h。待細(xì)胞達(dá)到40%～60%匯合度時，用DMEM清洗細(xì)胞面2次，第3次換成opti-MEM。配制轉(zhuǎn)染試劑(六孔板)，Ⅰ液：質(zhì)粒2.5 μg，P3000 5 μL，用opti-MEM補(bǔ)足125 μL；Ⅱ液lip3000 3.75 μL，opti-MEM 121.25 μL，將Ⅰ液與Ⅱ液1∶1混勻，室溫10～20 min后，加入六孔板中250 μL/孔。轉(zhuǎn)染6 h后，換成不含雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液。分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48和72 h檢測質(zhì)粒表達(dá)情況。

Western Blot檢測VP3蛋白的表達(dá)。取30 μg 蛋白經(jīng) 12% SDS-PAGE 凝膠分離，40 V濕轉(zhuǎn)2 h(4 ℃)，5%脫脂奶粉封閉 1 h，TBST洗膜3次(15 min/次)；加入兔抗VP3抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜；次日TBST 洗膜3次(15 min/次)后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶10 000)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后行ECL顯色。

1.8 重組質(zhì)粒pEGPF-N2-VP3對RV復(fù)制的影響

1.8.1 MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3后RV拷貝數(shù)檢測

pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞24 h后，用輪狀病毒ZTR-68感染細(xì)胞。24 h后將細(xì)胞取出，置于-20 ℃反復(fù)凍融3次；將病毒液4 ℃,8 000 r/min離心20 min后取上清提取病毒總RNA。用已知滴度(106.0PFU/mL)的RV標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行10倍梯度稀釋至102.0PFU/mL，進(jìn)行 one-step probe qRT-PCR，以標(biāo)準(zhǔn)毒株10為底的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，cq值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后檢測樣品Cq值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中RV拷貝數(shù)。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×Supermix 10 μL；上下游引物(20 μmol/mL)0.4 μL；Enzyme Mix 0.4 μL；RNA樣品500 ng; Probe (10 μmol/mL)0.4 μL；RNAase-free 水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 10 min；94 ℃ 預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃ 退火30 s，循環(huán)45次。

1.8.2 MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3后RV免疫熒光檢測

pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞24 h后，用輪狀病毒ZTR-68株感染細(xì)胞。病毒感染24 h后從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，PBS輕柔清洗細(xì)胞面1次，2%多聚甲醛4 ℃固定30 min(1 mL/孔)；取已提前預(yù)冷的甲醇4 ℃固定15 min(1 mL/孔)；PBS洗3次，每次5 min；2%BSA 37 ℃封閉45 min；PBS洗1次；加入山羊抗RV (1∶500稀釋)抗體，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗3次；加入Cy-3標(biāo)記的驢抗山羊(1∶200稀釋)二抗37 ℃孵育1 h；PBST洗3次后，DAPI(1∶1 000稀釋)染細(xì)胞核10 min；PBST洗3次，封片后用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.8.3 觀察GFP分布狀態(tài)

MA104 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5 48 h后接種RV，并分別在接種病毒0、8、12和24 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察 GFP 的分布狀態(tài)，以進(jìn)一步確認(rèn)重組蛋白VP3是否參與RV復(fù)制。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS 13.0 軟件做t檢驗(yàn)進(jìn)行樣本之間的兩組間比較。P≤ 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEGPF-N2-VP3表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可見1條大小與目的基因大小基本一致的片段，為1條695 bp的特異性片段。重組質(zhì)粒 pEGPF-N2-VP3經(jīng)EcoR I和SalI雙酶切后得到約 4 795 bp和 695 bp的 2個條帶(圖 1)。經(jīng)過測序Blast比對結(jié)果與VP3編碼序列一致，表明重組質(zhì)粒pEGPF-N2-VP3構(gòu)建成功。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染到MA104細(xì)胞中，分別于不同時段提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果顯示，48 h VP3蛋白表達(dá)最高(圖2)。

(a)Lane 1為RV-VP3基因擴(kuò)增；(b)Lane 1為pEGPF-N2基因擴(kuò)增；(c)Lane 1為pEGPF-N2-VP3雙酶切鑒定

(a)pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞不同時段重組蛋白VP3 Western Blot檢測;(b)各條帶灰度值

重組質(zhì)粒pEGFP-N2-VP3 轉(zhuǎn)染MA104 細(xì)胞后，分別于不同時段取出細(xì)胞，用倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布及表達(dá)情況。結(jié)果顯示, MA104細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有pEGFP-N2-VP3分布。pEGFP-N2-VP3表達(dá)量初期隨轉(zhuǎn)染時間逐步增高，且在48 h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)下降(圖3)。

圖3 pEGFP-N2-VP3 轉(zhuǎn)染MA104 細(xì)胞不同時間GFP熒光結(jié)果(×200)

2.2 轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3對RV復(fù)制的影響

MA104細(xì)胞經(jīng)過不同處理后分成3組(轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3；轉(zhuǎn)染pEGPF-N2空載體；不轉(zhuǎn)染)，于轉(zhuǎn)染24 h后感染等量RV(106.0PFU/mL)，并于感染24 h收獲病毒上清。用絕對定量法檢測各組收獲RV病毒液滴度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-4.9202x+ 50.585;R2=0.9997，將3組收獲的病毒液進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對應(yīng)的病毒滴度。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3組收獲的RV病毒滴度顯著高于轉(zhuǎn)染pEGPF-N2空載體組及不轉(zhuǎn)染的空白(Mock)組，而pEGPF-N2空載體組與Mock組并無顯著差異，表明重組蛋白VP3可促進(jìn)RV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制(圖4)。

(a)RV G1標(biāo)準(zhǔn)株的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線; (b)pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞24 h后接種RV并于24 h收獲RV上清且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出RV滴度(*P≤0.01)

此外，免疫熒光能夠更直觀地反應(yīng)重組蛋白VP3對RV復(fù)制的影響。3組不同處理的MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后感染RV，并于感染病毒16 h檢測RV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。結(jié)果顯示pEGPF-N2-VP3轉(zhuǎn)染組RV陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于pEGPF-N2 空載體轉(zhuǎn)染組和Mock(空白組)。結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了pEGPF-N2-VP3能夠促進(jìn)RV在宿主細(xì)胞能的復(fù)制[圖5(a)]。

MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGPF-N2-VP3后48 h接種RV，通過不同時間段GFP分布情況觀察發(fā)現(xiàn)，在未接種RV的細(xì)胞中，GFP呈現(xiàn)彌散均勻地分布，但當(dāng)感染RV后，隨著感染時間的增加GFP在細(xì)胞內(nèi)逐漸形成越來越緊密的點(diǎn)狀樣聚集。圖5(b)表明了重組蛋白VP3能夠參與RV復(fù)制過程，且對RV復(fù)制具有促進(jìn)作用。

(a)免疫熒光檢測N2-VP3轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞48 h后RV復(fù)制情況;(b)RV陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(×200)；(c)接種RV后0、8、12和24 h的GFP分布情況(×400)。*P≤0.01

3 討論與結(jié)論

輪狀病毒(Rotavirus)是引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的主要病原體，每年在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，尤其在中非、南亞等發(fā)展中國家[11]。固有免疫反應(yīng)是宿主細(xì)胞抵抗病毒感染的第一道防線。通過寡腺苷酸合成酶(OAS)合成2′-5′-寡腺苷酸(2-5A)是一種重要的先天細(xì)胞反應(yīng)，其通過激活潛在的細(xì)胞RNase、RNase L來降解單鏈RNA來限制病毒復(fù)制。在宿主細(xì)胞與病毒的這場博弈中，研究表明輪狀病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種策略來隱藏和直接拮抗宿主先天免疫系統(tǒng)[12]。這些途徑之一是2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)/ RNase L途徑。 OAS被雙鏈RNA(dsRNA)激活，產(chǎn)生2′-5′寡腺苷酸，它們是RNase L的激活劑；這種酶降解病毒和細(xì)胞RNA，限制病毒感染。最近發(fā)現(xiàn)輪狀病毒VP3的羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)具有2′-5′-磷酸二酯酶(PDE)活性，其能夠在功能上代替小鼠肝炎病毒ns2蛋白的PDE活性。這種特定的磷酸二酯酶切割寡腺苷酸的2′-5′-磷酸二酯鍵，拮抗OAS/RNase L途徑[13-16]。然而，在輪狀病毒的復(fù)制周期中VP3的這種活性是否相關(guān)尚不清楚。因此，深入探究VP3的功能及在輪狀病毒復(fù)制中的作用具有重要意義，且為后續(xù)研究RV的抗病毒機(jī)制提供理論依據(jù)。VP3基因全長為2 508 bp，由于構(gòu)建和表達(dá)全長的VP3基因存在困難，本研究選擇最長開放閱讀框(Open reading frame, ORF)進(jìn)行構(gòu)建和表達(dá)。

本研究旨在通過構(gòu)建RV-VP3基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染使其在MA104細(xì)胞中過表達(dá)，觀察過表達(dá)VP3對輪狀病毒復(fù)制的影響。首先利用基因重組技術(shù)將RV-VP3插入質(zhì)粒pEGPF-N2中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后48 h重組蛋白表達(dá)最高。然后于轉(zhuǎn)染48 h后感染病毒，通過免疫熒光和拷貝數(shù)檢測通過外源載體過表達(dá)VP3對輪狀病毒復(fù)制的影響，結(jié)果均顯示重組蛋白VP3可促進(jìn)病毒復(fù)制。當(dāng)輪狀病毒感染宿主細(xì)胞時，宿主啟動自噬病毒復(fù)制位點(diǎn)形成，熒光觀察呈現(xiàn)顆粒狀小點(diǎn)[17-18]。觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)RV感染宿主細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GFP熒光從最初的彌散分布狀態(tài)變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集，進(jìn)一步直觀說明重組蛋白VP3成功表達(dá)并參與RV復(fù)制。

因此，本研究成功構(gòu)建了VP3真核表達(dá)載體，使其在MA104細(xì)胞中過表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了pEGFP-N2-VP3重組質(zhì)粒能夠參與促進(jìn)RV復(fù)制，為后續(xù)更加深入探究VP3的功能及輪狀病毒的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。