晏俊玲，樊揚，秦川，歐雪,陳姝娟，敖曉琳

(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安， 625014)

苦竹筍為禾本科苦竹(Pleioblastusamarus)的嫩芽，廣泛分布于我國南方地區(qū)[1]。在我國不僅是一種傳統(tǒng)的綠色食品原料，還被用于民間醫(yī)學，治療痢疾、腹瀉、糖尿病、炎癥和傳染病等[2]。近年來，竹筍因其較高的藥用價值和開發(fā)利用前景而受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，苦竹筍中含有黃酮類、蛋白質(zhì)、膳食纖維、生物堿和木質(zhì)素及微量元素等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]?？嘀袢~和苦竹枝黃酮的純化工藝和生物活性已有報道，但目前對苦竹筍黃酮的純化工藝和生物活性尚未闡明。因此，本試驗以苦竹筍總黃酮含量為指標，通過考察大孔吸附樹脂對苦竹筍黃酮的吸附性能，篩選出最佳純化工藝條件。此外，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的RAW264.7細胞中，對純化的苦竹筍總黃酮的抗炎特性進行了評估，以期為后續(xù)開發(fā)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

苦竹筍采自四川省雅安市；蘆丁標準品(純度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；NaNO2、無水乙醇、NaOH等化學試劑均為分析純，大孔吸附樹脂ADS-17、HPD500、S-8、HPD400、HPD100、AB-8、X-5、NKA-9、D101，華溢新材料, 其主要性能參數(shù)見表1所示。

表1 大孔吸附樹脂的型號及物理性能Table 1 Models and physical properties of macroporous adsorption resin

1.2 儀器設(shè)備

Varioskan LUX酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；FA2004B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；FW135高速冷凍干燥機，永康市小寶電器有限公司；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18S真空冷凍干燥機，上海力辰邦西儀器科技有限公司；S28L超聲波清洗器，東莞市墨潔超聲波設(shè)備有限公司；7D-4Z臺式高速離心機，蜀科儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 苦竹筍總黃酮提取液的制備

苦竹筍經(jīng)凍干粉碎、脫脂處理后，在料液比1∶27(g∶mL)、乙醇體積分數(shù)88%、超聲功率200 W、提取溫度60 ℃、提取時間25 min的條件下，提取2次，過濾后合并2次濾液，減壓濃縮無醇味后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標準曲線的繪制及總黃酮含量測定

參照吳昊等[5]的方法并稍作修改。以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定苦竹筍總黃酮含量。精確稱取蘆丁標準品20.00 mg于20 mL的容量瓶中，并用體積分數(shù)60%乙醇溶解，即得1 mg/mL的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL 容量瓶中，分別加入300 μL的50 g/L NaNO2溶液，揺勻靜置5 min，再加入300 μL的100 g/L Al(NO3)3溶液，揺勻靜置5 min，最后加入4.0 mL 40 g/L NaOH溶液，體積分數(shù)為60%的乙醇定容，揺勻靜置15 min,在510 nm波長處測量吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線：y=4.845 2x-0.003 3，R2=0.999 8，根據(jù)標準曲線計算出總黃酮的含量。

2.3 靜態(tài)吸附與解吸實驗

2.3.1 大孔吸附樹脂選型

2.3.1.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

大孔吸附樹脂預(yù)處理參照馮靖等[6]的方法并略作修改。9種大孔吸附樹脂用去離子水沖洗，除去白色漂浮物，濾紙吸走樹脂水分，再用無水乙醇浸泡樹脂24 h，去離子水沖洗至無醇味，沖洗液無白色渾濁，40 g/L HCl溶液浸泡5 h，去離子水反復(fù)沖洗至中性，40 g/L NaOH溶液浸泡5 h，去離子水清洗樹脂至中性，濾紙吸去樹脂表面水分，備用。

2.3.1.2 樹脂吸附量、吸附率及解吸率的測定

準確稱量已處理好的9種大孔吸附樹脂(ADS-17, HPD500, S-8, HPD400, HPD100, AB-8, X-5, NKA-9, D101)各2 g分別放入錐形瓶中，向其中各加入粗提取液20 mL(總黃酮濃度1.55 mg/mL)，封口，在25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器上避光振蕩12 h，待充分吸附后，過濾，取上清液，按照2.2的方法測定吸光度值，按照公式(1)(2)計算樹脂吸附量和吸附率。將吸附后的樹脂分別加入20 mL體積分數(shù) 50%乙醇，封口后，置于20 ℃、120 r/min的氣浴恒溫搖床上連續(xù)振蕩12 h，使其完全解吸附，過濾后測定吸光度值。按照公式(3)計算樹脂解吸率[7]。

(1)

(2)

(3)

式中：q，飽和吸附量，mg/g；C1，苦竹筍粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2，吸附飽和后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1，吸附液總體積，mL；m，樹脂干重，g；C3，解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2，解吸液總體積，mL。

2.3.1.3 大孔吸附樹脂動力學實驗

準確稱取2.0 g AB-8樹脂置于錐形瓶中，再加入20 mL苦竹筍總黃酮粗提液(1.55 mg/mL)后將錐形瓶放于氣浴恒溫搖床內(nèi)，在25 ℃、120 r/min的條件下，充分振蕩12 h，每隔一定時間(0、10、20、30、40、50、60、90、120、270、360、480、600、720 min)取1 mL上清液，測定總黃酮質(zhì)量濃度[8]。為了更好地了解可能的吸附機理，實驗數(shù)據(jù)采用粒子內(nèi)擴散模型、準一級和二級模型進行分析，計算方程分別見公式(4)(5)和(6)[8]。

粒子內(nèi)擴散模型線性關(guān)系為：qt=kit0.5+C

(4)

準一級吸附動力學模型：ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(5)

(6)

式中：ki，擴散速率常數(shù)，mg/(g·min0.5)；k1，一級吸附速率常數(shù)，min-1；k2，二級吸附速率常數(shù)，g/(mg·min)；C，常數(shù)；qe，平衡時吸附量；qt，t時刻的吸附量，mg/g。

2.3.1.4 吸附等溫線和熱力學實驗[9]

制備不同質(zhì)量濃度(0.31、0.62、0.93、1.24、1.55、1.86 mg/mL)的總黃酮樣品，稱取2.0 g樹脂置于錐形瓶中，再加入20 mL樣品溶液，分成3組，每組含有6種不同濃度的樣品，分別置于25、35和45 ℃，120 r/min的氣浴恒溫搖床上連續(xù)振蕩12 h，測定總黃酮含量，為研究吸附特性，采用Freundlich和Langmuir模型對試驗數(shù)據(jù)進行分析，F(xiàn)reundlich和Langmuir模型的吸附等溫方程分別見公式(7)(8)：

(7)

(8)

式中:qm，最大吸附容量，mg/g,Ce，吸附平衡后的質(zhì)量濃度，mg/mL；KL，Langmuir模型的平衡常數(shù)，mL/mg；KF，F(xiàn)reundlich常數(shù)，(mg/g或mL/mg)1/n；1/n，n為表現(xiàn)常數(shù)，表示吸附優(yōu)惠性。

吸附熱力學分析能提供更多的理論信息，進一步揭示能量變化和吸附機理，因此分析等量吸附焓變(ΔH)、吸附自由能變(ΔG)、吸附熵變(ΔS)等研究AB-8樹脂的熱力學性質(zhì)[10]，具體計算見公式(9)(10)和(11)：

(9)

ΔG/(kJ·mol-1)=-lnKRT

(10)

(11)

式中：KL，Langmuir模型的平衡常數(shù)，mL/mg；M，蘆丁的摩爾質(zhì)量，610.51 g/mol；R，氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T，吸附溫度,K。

2.3.1.5 上樣液pH值對大孔吸附樹脂吸附的影響[9]

稱取AB-8樹脂2 g于具塞錐形瓶中，分別加入pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10的粗提液20 mL(總黃酮質(zhì)量濃度1.55 mg/mL)，然后將其置于25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器中，振蕩12 h，充分吸附后測定苦竹筍總黃酮質(zhì)量濃度，并計算其吸附率。

2.3.1.6 乙醇濃度對大孔吸附樹脂解吸的影響

取充分吸附飽和的AB-8樹脂2 g于具塞錐形瓶中，分別加入20 mL體積分數(shù)為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進行解吸，置于25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h，充分解吸后測定苦竹筍總黃酮質(zhì)量濃度，并計算其解吸率。

2.4 動態(tài)吸附與解吸實驗

為探索最優(yōu)的富集工藝，利用層析柱(1.6 cm×50 cm)填充AB-8樹脂，進行動態(tài)吸附與解吸實驗。本實驗中，床層體積為25 mL。采用不同流速(1、2、3、4 BV/h)(1 BV=25 mL)負載粗液(總黃酮質(zhì)量濃度1.55 mg/mL)進行吸附工藝研究，根據(jù)樹脂柱對總黃酮吸附能力選擇最佳流速及流量。先用去離子水沖洗樹脂柱進行動態(tài)脫附處理，然后以不同流速(1、2、3、4 BV/h)用體積分數(shù)50%乙醇溶液解吸處理，來優(yōu)化解吸液的流速和用量。

2.5 工藝驗證

按照上述試驗所確定的純化苦竹筍黃酮的最佳工藝條件，進行驗證，收集洗脫液，濃縮后凍干成粉末。按照公式(12)計算純度：

(12)

2.6 抗炎活性研究

2.6.1 總黃酮純化液的制備

稱取苦竹筍粉末50 g，按照2.1的方法制備苦竹筍總黃酮粗提液，再根據(jù)最優(yōu)純化工藝進行處理，減壓濃縮后無醇味置于4 ℃中備用。

2.6.2 抗炎活性測定

RAW264.7細胞培養(yǎng)于質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清和質(zhì)量分數(shù)1%青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃，體積分數(shù)5% CO2及適宜濕度條件下在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再參照段慶等[11]的方法并稍作修改，采用Griess法檢測苦竹筍總黃酮純化物對RAW264.7細胞產(chǎn)NO活性的抑制作用，將1×104個/孔RAW264.7細胞接種于細胞96孔板中，每孔體積為100 μL，接種孔周圍加入新鮮培養(yǎng)基用來排除邊緣效應(yīng)，待細胞貼壁后棄去多余培養(yǎng)基，并進行藥物處理。各孔藥物處理組分為：陰性對照組(不含有LPS和樣品)；模型組(LPS組，含有0.5 μg/mL LPS)；實驗組(總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.14、0.32、0.5、0.68、0.86、1.04 mg/mL)。分別預(yù)處理2 h后，除陰性對照組外各組均加入0.5 μg/mL LPS 0.5 μL處理18 h，再吸取50 μL細胞培養(yǎng)上清液，依次加入恢復(fù)室溫后的Griess ResgentⅠ50 μL和Griess ResgentⅡ50 μL，充分反應(yīng)后于550 nm波長處檢測吸光度。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 九種大孔吸附樹脂對苦竹筍總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸性能

9種大孔樹脂對苦竹筍總黃酮吸附能力和解吸能力對比研究結(jié)果見圖1。大孔吸附樹脂對成分的分離特性受很多因素的影響，如樹脂的比表面積、極性和孔徑大小、溶液性質(zhì)等[13]。根據(jù)圖1可知，因樹脂的物理化學性質(zhì)不同導(dǎo)致在相同條件下出現(xiàn)不同的結(jié)果，9種大孔樹脂對苦竹筍總黃酮的“吸附-解吸”能力都有所不同，其中HPD100、HPD400和AB-8型樹脂對黃酮類化合物的吸附能力及解吸能力均優(yōu)于其他樹脂，AB-8的吸附解吸性能最佳，其吸附率79.65%，解吸率68.73%。AB-8是弱極性樹脂，可推測苦竹筍中含有弱極性黃酮，3種樹脂的比表面積相差不大，而平均孔徑AB-8明顯大于HPD400和HPD100，說明在本研究中，樹脂的極性性質(zhì)和孔徑對吸附解吸過程影響較大。綜合考慮幾種大孔樹脂的吸附量、吸附率和解吸率,選擇AB-8進行吸附動力學研究。

圖1 九種樹脂對總黃酮的吸附/解吸率及吸附量Fig.1 Adsorption/desorption ratio and adsorption capacity of total flavonoids of different resins

3.2 大孔吸附樹脂動力學實驗

吸附動力學研究對設(shè)備選型和工藝設(shè)計具有重要意義。本文研究了在25 ℃條件下，苦竹筍總黃酮在AB-8樹脂上的吸附動力學性質(zhì)，如圖2-a顯示，AB-8樹脂對總黃酮的吸附能力在0～120 min快速上升，之后緩慢上升，400 min達到吸附平衡，其平衡時吸附量達到12.77 mg/g?？赡苁且驗閯傞_始吸附時(0～100 min)，樹脂表面可提供充足的吸附位點，吸附初期樣品溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度較高，可提供較大的推動力來克服阻力，吸收速率較快。隨著吸附時間延長到達吸附中期(100～300 min)，樹脂的吸附位點趨于飽和，溶質(zhì)從樹脂表面進入其內(nèi)部時受到一定阻力，吸附速率隨之減慢。最后吸附處于平衡階段(400～720 min)[14]。

圖2b-d顯示的是在25 ℃條件下擬合的3種動力學模型，其吸附動力學方程及相關(guān)參數(shù)如表2所示。在粒子內(nèi)擴散動力學模型中，當擬合的qt對t0.5的曲線是一條過原點的直線，說明吸附速率是由粒子內(nèi)擴散來控制的，如果是一條不通過原點的直線或者是混合曲線時，說明吸附速率不僅受粒子內(nèi)部擴散控制，同時還受液膜層擴散控制[8]。從圖2-b可知，擬合曲線是混合曲線，呈現(xiàn)出2個階段，可見吸附速率是由液膜層擴散和粒子內(nèi)擴散雙重控制的。由表2中AB-8樹脂對總黃酮的吸附動力學方程及參數(shù)可知，準二級動力學模型擬合結(jié)果的線性關(guān)系較好，其相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，粒子內(nèi)擴散動力學相關(guān)系數(shù)最小，兩階段分別為0.996 9和0.977 7。因此，AB-8大孔樹脂對苦筍總黃酮的吸附作用更符合準二級動力學吸附模型，且由準二級動力學模型擬合得出的qe與實驗測定的qe較為接近。

圖2 總黃酮在AB-8樹脂上的吸附動力學曲線(a)、粒子內(nèi)擴散(b)、準二級(c)和準一級(d)吸附模型擬合曲線Fig.2 Adsorption kinetics curves (a), intra-particle diffusion (b), quasi-secondary (c) and quasi-primary (d) of total flavonoids on AB-8 resin

表2 AB-8樹脂對總黃酮的吸附動力學方程及參數(shù)Table 2 Adsorption kinetics equations and parameters of total flavonoids on AB-8 resin

3.3 吸附等溫線模型

通常用線性擬合來描述不同溫度下不同濃度的樣品(吸附質(zhì))和吸附劑的吸附平衡關(guān)系[15]。3個不同溫度條件下AB-8樹脂對總黃酮的吸附等溫線及其線性相關(guān)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出，隨著樣品初始總黃酮濃度增加，吸附能力增強。黃酮濃度較低時，吸附能力迅速提高，吸附后平衡濃度(Ce)達0.5 mg/mL左右時達到飽和，其吸附量趨于平衡，此時上樣液總黃酮濃度為1.55 mg/mL?？赡苁且驗樯蠘右簼舛仍黾?，與樹脂單位表面積接觸的黃酮較多，吸附性能較好[16]，但上樣液濃度過高，雜質(zhì)也會增加，樹脂容易堵塞，同時也會出現(xiàn)吸附過載的情況，使得苦竹筍中的總黃酮沒有被吸附完全，也易發(fā)生沉淀和絮凝等現(xiàn)象，因此最佳吸附濃度為1.55 mg/mL。并且溫度越低，平衡時吸附量越高，25 ℃時平衡吸附量約12.00 mg/g左右，由此可知適當?shù)慕禍赜兄贏B-8樹脂對苦竹筍總黃酮的吸附。

圖3 不同溫度條件下AB-8樹脂對總黃酮的吸附等溫線及其線性相關(guān)Fig.3 Adsorption isotherm of AB-8 resin on total flavonoids at different temperatures and its linear correlation

Langmuir模型描述的是單分子層吸附過程，所有吸附位點均勻且具有相同的能量，被吸附分子之間沒有相互作用，而單分子層和多分子層的吸附都可以用Freundlich模型模擬，F(xiàn)reundlich模型吸附位點位于非均相表面上且具有不同能量，吸附分子間可能存在相互干擾[17]。

表3 不同溫度條件下AB-8樹脂對總黃酮的吸附影響 單位：mg/mL

圖4建立了分別在25、35、45 ℃條件下AB-8樹脂對總黃酮的Langmuir 和Freundlich 模型及其線性相關(guān)，表4總結(jié)了3種溫度下的吸附等溫線回歸方程及其相關(guān)參數(shù)，從表3中可看出，Langmuir模型模擬的回歸方程相關(guān)系數(shù)總體高于Freundlich模型，說明Langmuir吸附等溫線更能準確反映苦竹筍黃酮在AB-8樹脂上的吸附過程。由Langmuir等溫線模型可知，當溫度從25 ℃提高到45 ℃時，qm從14.13降至13.75 mg/g，表明苦竹筍總黃酮對AB-8型樹脂的吸附是放熱的。而在Freundlich等溫線模型中，25 ℃時，KF值最高，吸附溫度升高而KF值反而降低，說明吸附也是放熱的，這與等溫吸附曲線(圖3)所呈現(xiàn)的結(jié)果相同。因為溫度升高可能會加速溶液中分子的熱運動，從而降低黃酮與樹脂活性部位之間的接觸力，從而降低吸附量[18]。同時1/n值在0.1～0.5，說明AB-8樹脂對苦竹筍總黃酮的吸附是有利的。

3.4 熱力學實驗

以1/T為橫坐標，lnK為縱坐標對Van’t Hoff方程進行線性擬合，由直線的斜率和截距可分別算出ΔH和ΔS，相關(guān)熱力學參數(shù)表5。

圖4 不同溫度條件下AB-8樹脂對總黃酮的Langmuir (a) 和Freundlich (b)模型及其線性相關(guān)Fig.4 Langmuir (a) and Freundlich (b) models of AB-8 resin on total flavonoids at different temperatures and their linear correlation

表4 AB-8樹脂對總黃酮的吸附等溫線方程及其相關(guān)參數(shù)Table 4 Adsorption isotherm equations and parameters of total flavonoids on AB-8 resin

表5 不同溫度下的熱力學參數(shù)Table 5 Thermodynamic parameters at different temperatures

25、35、45 ℃時吸附熱力學參數(shù)如表4所示。ΔG<0說明吸附是自發(fā)的，ΔH<0表明該吸附是放熱的，這與等溫吸附模型結(jié)果一致，此外，ΔH<40 kJ/mol且0 kJ/mol<|ΔG|<20 kJ/mol,表明AB-8樹脂對苦竹筍總黃酮的吸附是物理吸附過程，這符合常規(guī)大孔吸附樹脂的吸附規(guī)定[12]。同時ΔS>0，這可能是由于吸附過程中，溶質(zhì)吸附同時也伴隨著溶劑脫附，即溶劑置換過程，隨著樹脂表面的吸附位點不斷被黃酮分子覆蓋，大量水分子脫附，吸附體系中溶質(zhì)的體積遠遠大于溶劑(水)的體積，同時水的摩爾體積小于吸附質(zhì)的摩爾體積，更有利于在溶液中作自由運動，而水分子脫附產(chǎn)生的熵變也大于總黃酮吸附所產(chǎn)生的熵變，所以導(dǎo)致整個吸附體系混亂度增加。這于徐祖?zhèn)サ萚12]研究結(jié)果相似。

3.5 pH對AB-8樹脂吸附性能的影響

上樣液pH值對樹脂的吸附能力有重要影響。pH值可以通過影響樣品分子的電離程度來影響溶質(zhì)與吸附劑之間的親和力[19]。如圖5所示，當樣品溶液pH值從2增加到7時，樹脂吸附率呈上升趨勢，在pH值為7時達到最大吸附率(75.17%)，而后吸附率不斷下降。可見，過酸過堿的環(huán)境都會影響樹脂對苦竹筍總黃酮的吸附，也有研究表明黃酮類化合物在過酸過堿的環(huán)境中的穩(wěn)定性較差[6]，這可能由于pH較高，黃酮類化合物中的酚羥基更易分離H+，氫鍵相互作用減少，從而導(dǎo)致出現(xiàn)較低的吸附能力。因此最佳上樣液pH值為7。

圖5 上樣液pH值對吸附率的影響Fig.5 Effect of pH value on adsorption rate

3.6 乙醇體積分數(shù)對AB-8樹脂解吸性能的影響

乙醇是一種易于從溶液中去除、可循環(huán)利用、價格低廉的有機溶劑，因其安全性較好在實驗室應(yīng)用廣泛[20]。因此，在本研究中，選取不同體積分數(shù)(10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇作為洗脫液，對苦竹筍總黃酮進行靜態(tài)解吸，結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響Fig.6 Effect of concentration of ethanol concentration on adsorption rate注:與乙醇體積分數(shù)50%相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

結(jié)果表明，其解吸率分別為15.83%、47.89%、77.79%、39.15%、32.96%。由此可見，隨著洗脫劑濃度的增加，解吸率也在增加，當乙醇濃度達到50%時，解吸率最大，而后解吸率反而降低。曾有相似研究也證實，黃酮類化合物不易溶解在較低濃度的乙醇中，而一些醇溶性雜質(zhì)可能溶解在高濃度的乙醇中，導(dǎo)致解吸性能在一定程度上下降[21-22]。

并且樹脂分子之間的吸附力與溶解度之間的相互作用對樹脂中黃酮類化合物的解吸起著重要作用，當分子間作用力達到穩(wěn)定時，黃酮類化合物會從樹脂中解吸到溶劑中。黃酮類化合物與樹脂之間也存在范德華力，當兩者極性相近時，范德華力最大，AB-8為弱極性樹脂，這也說明苦竹筍總黃酮樣液中的黃酮類化合物極性較弱。因此50%(體積分數(shù))乙醇為苦竹筍總黃酮最佳洗脫劑。

3.7 動態(tài)吸附解吸

上樣液體積和流速與飽和吸附量有很大的關(guān)系，因此通常建立不同上樣液流速下的動態(tài)吸附曲線來優(yōu)化上樣液的流速和體積。上樣液流速影響黃酮樣液向樹脂內(nèi)表面擴散，決定吸附效果，流速過大，黃酮樣液未完全被樹脂接觸，提早泄露，吸附性能降低；而流速過小，所需時間延長，生產(chǎn)效率低[23]。由圖7-a可知，流速越低，因適當延長了吸附時間，越晚達到泄露臨界點。這可能是由于適當延長吸附時間對粒子內(nèi)擴散過程及液膜層擴散有良好的影響，從而有助于提高吸附能力。一般情況下，流出液的目標物質(zhì)質(zhì)量濃度達到上樣液目標物質(zhì)質(zhì)量濃度的1/10時，認為達到了目標物質(zhì)的泄露點，流速為1、2、3、4 BV/h時，泄露體積分別約為4.2、3.2、2.8、2.4 BV，因此綜合考慮1 BV/h為最佳上樣流速，進樣體積為4.2 BV(105 mL)。由圖7-b可知，洗脫流速為4 BV/h時，解吸性能較好。洗脫速度為1、2、3、4 BV/h時，洗脫量分別約為4.5、5.8、6.5、8 BV，回收率達到50.96%、58%、64.52%、75.58%。因此選取4 BV/h為最佳流速，洗脫體積為8 BV(200 mL)。

圖7 AB-8樹脂柱在不同流速下總黃酮的動態(tài)吸附曲線(a)和動態(tài)解吸曲線(b)Fig.7 Dynamic breakthrough curves (a) and dynamic desorption curves (b) of total flavonoids on AB-8 resin column at different flow rates.

3.8 驗證實驗

通過上述試驗，確定了最適宜純化苦竹筍總黃酮的樹脂以及純化工藝條件，并且最佳工藝條件下，上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為1.55 mg/mL，樣液pH值為7，以1 BV/h的流速上樣4.2 BV(105 mL)，充分吸附后以去離子水沖至無色，再用體積分數(shù)50%乙醇以4 BV/h的流速進行洗脫，洗脫體積為8 BV(200 mL)。結(jié)果表明，經(jīng)AB-8樹脂柱層析進一步富集后，總黃酮回收率可達到(75.58±0.47)%，純度由原來的(2.46±0.59)%提高至(15.72±0.48)%，提高了約7倍。經(jīng)驗證實驗確定該條件有效可行，適宜于苦竹筍黃酮的純化。

3.9 抗炎活性

NO作為一種重要的炎性介質(zhì)，其濃度是評價炎癥反應(yīng)程度的重要指標[24]。粗提液與純化液樣品在不同總黃酮濃度(0.14～1.04 mg/mL)下的NO濃度對比結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，LPS能極顯著地誘導(dǎo)RAW264.7細胞NO的增加，NO濃度由4.84 μmol/L上升到38.47 μmol/L，增加了約8倍，與LPS組相比，不同質(zhì)量濃度的樣品液處理后,細胞NO生成量均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，各樣品對NO濃度的抑制隨濃度的增加而增強，同等黃酮濃度下純化液的NO濃度普遍低于粗提液樣品，可見NO抑制率純化液樣品強于粗提液樣品，純化液樣品總黃酮濃度達到1.04 mg/mL抑制率可達到97.80%，最終NO濃度為5.60 μmol/L，而同一濃度下的粗提液樣品中NO濃度為13.81 μmol/L，抑制率僅為73.22%，說明苦竹筍總黃酮純化液可更好地抑制LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞中NO的產(chǎn)生，本研究的苦竹筍純化方法是有效的。

圖8 苦竹筍總黃酮純化液對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞NO生成量的影響Fig.8 Effect of total flavone purification solution on NO production in LPS-induced mouse macrophages注:與LPS組比較:*表示P<0.05、**表示P<0.01

4 結(jié)論

本實驗探討了苦竹筍總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝，并對其體外抗炎活性進行研究。在進行動態(tài)吸附和解吸試驗之前，先對樹脂的篩選、吸附動力學、吸附等溫線和熱力學進行了研究。研究結(jié)果表明AB-8型樹脂為最佳大孔樹脂，對苦竹筍總黃酮吸附率為79.65%、解吸率為68.73%，準二級動力學模型和Langmuir等溫線模型對吸附數(shù)據(jù)進行了最佳描述，吸附過程放熱，降溫有利于吸附。確定純化最優(yōu)工藝為：上樣液濃度1.55 mg/mL，上樣液pH值為7，洗脫劑濃度50%(體積分數(shù))，上樣量4.2 BV(105 mL)、上樣流速1 BV/h、洗脫劑用量8 BV(200 mL)、洗脫流速4 BV/h，經(jīng)AB-8樹脂柱層析進一步富集后，總黃酮回收率可達到(75.58±0.47)%，純度由原來的(2.46±0.59)%提高至(15.72±0.48)%。此外，NO是一種常見的炎性介質(zhì), 過量的NO可導(dǎo)致一系列炎癥疾病的發(fā)生[25]。通過對粗提樣品和純化樣品的體外抗炎活性評價結(jié)果顯示，同等黃酮濃度下純化液的NO濃度普遍低于粗提液樣品，純化樣品總黃酮濃度為1.04 mg/mL，抑制率可達到97.80%，最終NO濃度為5.60 μmol/L，而同一總黃酮濃度下的粗提樣品中NO濃度為13.81 μmol/L，抑制率僅為73.22%，由此說明，經(jīng)富集后的苦竹筍總黃酮表現(xiàn)出較好的抗炎活性。綜上所述，本實驗建立了苦竹筍總黃酮的富集方法，且開發(fā)的純化富集物是有效可行的，適用于苦竹筍總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)，后續(xù)可進一步通過各種色譜技術(shù)探索建立高純度總黃酮的富集純化方法。