林柳，陶寧萍,2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

金槍魚是生活在綠色無污染的熱帶-亞熱帶海洋深處的大洋性魚類，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)物質(zhì)豐富且味道鮮美，被譽為“海洋黃金”[1]。頭部是金槍魚加工過程中主要的副產(chǎn)物之一[2]，不僅富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和礦物質(zhì)元素，且氨基酸種類齊全。魚頭中脂肪含量普遍高于魚身，且含有鈉、鈣等豐富的礦質(zhì)元素[3]。眼窩中還含有大量的多不飽和脂肪酸，特別是二十二碳六烯酸含量高達(dá)30%～40%[4]。若將大眼金槍魚頭制作成金槍魚頭湯，則可以有效減少資源的浪費且豐富湯品種類。

微/納米顆粒(micro/nano-sized particles,MNPs)是食物中營養(yǎng)物質(zhì)的重要存在形式，通常存在于新鮮牛奶、中草藥和加工后的果汁中[5]。已有研究表明河蜆湯[6]、骨湯[7]、金槍魚頭湯[8-9]、三文魚和鳙魚頭湯[10]中均存在由營養(yǎng)物質(zhì)間通過組分相互自組裝形成的尺寸分布范圍從微米級到納米級不等的顆粒。KE等[11]研究表明，從骨湯中分離得到的MNPs具有一定的藥用價值。

體內(nèi)或體外實驗是了解食品、藥品或者新功能產(chǎn)品消化行為及特性的重要方法。體外實驗由于其成本低、不可控因素少、試驗周期短、可重復(fù)性高且不受倫理道德限制等特點而被廣泛接納?，F(xiàn)已有研究報道了從單一靜態(tài)反應(yīng)器到多腔室的動態(tài)消化系統(tǒng)[12-14]，但如何更貼近真實地反應(yīng)體內(nèi)的消化行為仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。體外仿生消化系統(tǒng)[15]是在遵循人體解刨學(xué)原理的前提下，制作出與人體胃腸道相似的仿生硅膠模型，由進(jìn)料口、食管、胃、十二指腸和小腸等主要部件構(gòu)成，通過電機和空壓機同時工作，使胃腸道消化過程連續(xù)性發(fā)生。

本研究借助魚湯熬煮過程中天然形成的魚油MNPs，通過優(yōu)化體外仿生消化系統(tǒng)的運動參數(shù)，對MNPs的消化特性進(jìn)行分析，為人工魚油制劑和配方提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚頭[30個,質(zhì)量(1.52±0.19) kg,長(27.09±2.04) cm,寬(25.69±1.00) cm]，大連翔祥食品有限公司；大豆油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；KCl、KH2PO4、NaCl、MgCl2·6H2O、(NH4)2CO3、Na2CO3、濃鹽酸、CaCl2·2H2O,均為AR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶(V900497)、胰酶(P7545)，美國Sigma-Aldrich公司；豬膽鹽，上海麥克林生化科技有限公司；載玻片(4951PLUS-001E)，美國Thermo Fisher公司；蓋玻片(10212020C)，江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

體外仿生消化系統(tǒng)(DHSI-Ⅳ)，曉東宜健(蘇州)儀器有限公司；恒溫水浴鍋(HWS-24)，上海恒科學(xué)儀器有限公司；精密pH計SC-412，梅特勒-托利多儀器有限公司；數(shù)碼相機(550D)，佳能(中國) 有限公司；倒置生物顯微鏡(MS600F)，上海名茲精密儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚頭湯的熬煮

參考QIAN等[8]方法并略作修改。冷凍的魚頭用流水解凍后切成3 cm×3 cm×2 cm的小塊，清洗干凈后晾干。大豆油(20±1)g在120 ℃預(yù)熱30 s后加入魚頭(400±2) g油煎40 s。隨后在油煎后的魚頭中加入3.2 kg飲用水,在97 ℃下熬煮30 min后，再于90 ℃下熬煮120 min。將熬煮150 min后的魚頭湯分裝于150 mL的小瓶中待用。

1.3.2 消化液模擬液的配制

胃液模擬液(simulated gastric fluid,SGF)和腸液模擬液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制參考MINEKUS等[16]的方法，具體見表1。

表1 模擬消化液的制備Table 1 Preparation of simulated digestion fluids

以配制100 mL的SGF為例，稱取600 mg胃蛋白酶溶解于75 mL SGF濃縮液中(使得胃蛋白酶的最終酶活力為4 000 U/mL)，再加入0.05 mL 0.3 mol/L的CaCl2溶液和24.95 mL去離子水，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0。同樣SIF的配制也以100 mL為例，稱取0.4 g胰酶和0.85 g膽鹽溶劑于75 mL的SIF濃縮液中(使得胰酶的最終酶活力為200 U/mL、膽鹽的最終濃度為20 mmol/L)，加入0.2 mL 0.3 mol/L的CaCl2溶液和24.8 mL去離子水，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.3.3 胃排空運動參數(shù)的確定

食物從胃排到十二指腸的過程稱為胃排空，一般發(fā)生在食物進(jìn)入胃的5 min后。食物在體內(nèi)的胃排空情況受其物理狀態(tài)和化學(xué)組成的影響，已有文獻(xiàn)表明[17-18]，排空300 mL的純水需要1 h，混合果汁和牛肉食用時，排空時間需要2 h。因此，本實驗基于已有的體內(nèi)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)且為更好的重現(xiàn)魚湯在胃內(nèi)的消化狀態(tài)，將胃內(nèi)的消化時間確定為2 h。

1.3.3.1 模擬胃消化和排空

通過改變設(shè)備的運動參數(shù)，制作胃排空曲線與體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，最終重現(xiàn)近似于體內(nèi)的胃排空曲線。胃傾斜角的變化和幽門打開頻率是影響胃排空曲線的重要因素，在大量前期預(yù)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本實驗設(shè)置了2組微調(diào)實驗，即不同的胃傾斜角和不同幽門打開頻率對胃排空曲線的影響，以300 mL魚湯和150 mL模擬胃液消化液為例，具體參數(shù)見表2和表3。

表2 不同胃傾斜角對胃排空曲線的影響Table 2 Effects of different gastric tilt angles on gastric emptying curve

表3 不同幽門打開頻率對胃排空曲線的影響Table 3 Effects of different opening frequency of pylorus on gastric emptying curve

1.3.3.2 胃內(nèi)剩余百分比的計算

每30 min取1次樣，計算排出的液體占總量的比值，得出胃內(nèi)剩余的百分比，重復(fù)3次實驗。按公式(1)計算

(1)

式中：ω，胃內(nèi)剩余百分比，%；m1，胃內(nèi)排出的液體質(zhì)量，g；m2，進(jìn)入胃內(nèi)食物的質(zhì)量，g；V，空腹胃液體積，mL；v，胃液流速，mL/min；t，取樣的時間，min；ρ，注入的胃液的密度，g/mL。

1.3.4 模擬胃腸道消化

在消化開始時，提前20 min 打開體外仿生消化系統(tǒng)的控溫系統(tǒng)，即環(huán)境加熱和水浴加熱，使實驗開始時系統(tǒng)溫度為37 ℃，同時將300 mL魚湯、150 mL SGF和450 mL SIF在水浴鍋37 ℃中預(yù)熱。按表4設(shè)置設(shè)備運行參數(shù)。實驗前設(shè)置蠕動泵工作，使得消化液充滿分泌管。實驗過程中每30 min取1次樣，并置于4 ℃以抑制酶活性備用。

表4 設(shè)備運行參數(shù)Table 4 Equipment operating parameters

1.3.4.1 pH變化

每10 min取1次樣，取樣后，立即用pH計測定，并記錄。

1.3.4.2 金槍魚頭湯中MNPs形貌特征的觀察

每30 min收集1次樣，用于顯微鏡觀察。取15 μL消化物于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，用倒置生物顯微鏡(×50目鏡)觀察金槍魚頭湯在胃腸道消化過程中MNPs的形態(tài)變化。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2018對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和生成圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 胃傾斜角和幽門打開頻率對胃排空曲線的影響

胃排空行為在整個人體消化系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位，其不僅影響著食物的消化吸收，也與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此在模擬體外消化的過程中是不可忽視的，有必要通過運動參數(shù)的調(diào)節(jié)使其接近體內(nèi)真實情況，從而保證實驗的真實可靠性。不同胃傾斜角和幽門打開頻率對胃排空曲線的影響，如圖1所示。

a-胃傾斜角；b-幽門打開頻率圖1 不同胃傾斜角和不同幽門打開頻率對胃排空曲線的影響Fig.1 Effects of different gastric tilt angles and opening frequency of pylorus on gastric emptying curve

圖1-a呈現(xiàn)的是在保持胃擠壓次數(shù)不變，即胃擠壓3次，幽門打開1次的情況下，通過改變胃傾斜角度，得到的不同的胃排空曲線。由圖1-a可知，在消化過程中沒有出現(xiàn)明顯的胃排空滯留現(xiàn)象，且3條曲線的變化趨勢大致一致，呈現(xiàn)一種近似于指數(shù)型的排空，這與體內(nèi)實驗的排空曲線類似[17]。在前30 min，3組數(shù)據(jù)的胃傾斜角度一致，因而這段曲線完全重合。在30～60 min，胃排空曲線出現(xiàn)差異性，A曲線在B和C的上方，表明在參數(shù)A的條件下，魚湯的排空速率最低，同樣可以推斷出，曲線C的排空速率最快。在60 min的時間點上出現(xiàn)明顯的差異是由于在這30 min內(nèi)，參數(shù)C整體比A多移動了6°，比B多移動了3°，同時說明了胃傾斜角與胃排空速率直接相關(guān)。在90 min的時間點上，曲線B、C的數(shù)據(jù)點時間相互靠近，是由于在30～90 min，2組參數(shù)的總傾斜角度是一樣的。在90～120 min，曲線A的下降速率大于B和C，且在排空終點曲線B、C的數(shù)據(jù)點幾乎重合，這與整個排空過程中的總傾斜角度有關(guān)。在胃排空終點，參數(shù)B和C胃內(nèi)殘余液體約為6.2%，與體內(nèi)約為5.0%[18]更為接近，且曲線C的變化更為平緩，與體內(nèi)的排空曲線更接近，因此優(yōu)選參數(shù)C進(jìn)行下一步優(yōu)化。

在參數(shù)C的基礎(chǔ)上保持胃傾斜角不變，改變幽門的打開頻率，結(jié)果如圖1-b所示。胃排空曲線受幽門頻率的影響不大，都在可接受的范圍之內(nèi)。這可能與樣品的物理性質(zhì)有關(guān)，魚湯屬于液體食物，排空速度較快，幾乎可以忽略粒徑、黏度等因素的影響。綜合以上結(jié)果與體內(nèi)排空果汁的數(shù)據(jù)[18]，最終確定胃傾斜角和幽門打開頻率的運動參數(shù)為：傾斜角在0～1 min為0°/min，1～4 min為3°/min，4～31 min為-0.1°/min，31～61 min為-1.0°/min，61～91 min為-0.4°/min，91～121 min為-0.1°/min；幽門在0～6 min胃擠壓次數(shù)為30次，6～121 min胃擠壓次數(shù)為3次。

2.2 金槍魚頭湯在體外防生消化系統(tǒng)中的胃消化

2.2.1 胃內(nèi)的pH變化

在體外模型中創(chuàng)建與實際人胃中相似的pH變化曲線對于有效模擬消化過程至關(guān)重要。因為不同食物自身物理性質(zhì)和緩沖能力的差異性，使其在胃內(nèi)的pH的呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，食物在經(jīng)口攝入再進(jìn)入胃時，pH值會出現(xiàn)不同程度的滯后期[19]。人體進(jìn)食后，胃液分泌，pH急劇降低，隨著胃排空的進(jìn)行，胃內(nèi)pH逐漸達(dá)到空腹胃液的狀態(tài)[20]。經(jīng)過多次實驗，最終得到了貼近體內(nèi)pH數(shù)據(jù)的設(shè)備運行參數(shù)，即在設(shè)備運行1 min內(nèi)以15 mL/min的速度流加30 mL胃液，即空腹胃液；用備用泵在1～21 min以0.3 mL/min的速度流加1 mol/L的HCl溶液用于調(diào)節(jié)胃內(nèi)pH。

圖2顯示了在體外防生消化系統(tǒng)中金槍魚頭湯在模擬胃消化過程中pH的變化。可以看出，魚湯在模擬胃的消化過程中，pH值從6.8(0 min)逐漸下降到1.8(30 min)，這與SULLIVAN等[21]的研究變化趨勢一致，與靜態(tài)實驗pH值存在差異，靜態(tài)實驗忽略了人體真實的pH變化，簡單將pH定為2或者1.5，這與體內(nèi)數(shù)據(jù)不符。在30～120 min時，胃內(nèi)pH維持在1.5左右。課題組前期研究結(jié)果表明[13]，金槍魚頭湯中的MNPs是由甘油三酯為核心，蛋白質(zhì)、磷脂和糖基化分子在外圍的球形顆粒。胃消化過程中胃蛋白酶將大分子蛋白質(zhì)降解，脂肪酸鏈上的基團(tuán)隨之暴露，因此在30 min后仍伴有小范圍內(nèi)的波動。這也表明通過運動參數(shù)的調(diào)節(jié)，體外仿生消化系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確反映動態(tài)胃消化。

圖2 不同時期胃內(nèi)的pHFig.2 pH in the stomach at different times.

2.2.2 胃內(nèi)MNPs的微觀結(jié)構(gòu)變化

用數(shù)碼相機對胃中的消化物進(jìn)行記錄(圖3-a)，觀察其外觀的變化，用光學(xué)顯微鏡觀察魚湯中MNPs的變化(圖3-b～圖3-h)。由圖3-a可知，新鮮熬煮的魚湯呈乳白色，隨著消化過程的進(jìn)行魚湯從均一的乳白色逐漸變得澄清透亮，接近于胃液的顏色且并未發(fā)現(xiàn)明顯的油水分層現(xiàn)象。這是由于在胃消化過程中，胃排空在連續(xù)性發(fā)生，胃中的魚湯不斷排向十二指腸且胃液不斷對其進(jìn)行稀釋。從圖3-b～圖3-h可知，在胃消化過程中，MNPs的結(jié)構(gòu)變化顯著。在消化開始前，魚湯中的MNPs均勻的分布在水相中，在消化10 min時，可觀察到MNPs的外圍膜發(fā)生破裂且相鄰顆粒之間開始出現(xiàn)聚集性行為，這是因為MNPs是由天然的脂肪球膜包被，有蛋白質(zhì)、磷脂、糖脂等[22]，胃蛋白酶將蛋白質(zhì)水解，破壞了MNPs天然的膜結(jié)構(gòu)，MNPs重新分布，發(fā)生聚集。這與LIANG等[23]發(fā)現(xiàn)牛乳經(jīng)胃消化后的脂肪球粒徑較消化前變大的研究結(jié)果一致。在20 min時，形成了不規(guī)則的球形且粒徑變大;在消化進(jìn)行到30 min時,可觀察到規(guī)則的球形且外圍變得清晰而完整。在接下來的消化過程中，可發(fā)現(xiàn)粒徑較小的MNPs依然在不斷靠近但MNPs的數(shù)量明顯減少，這是由于胃排空的連續(xù)性發(fā)生且魚湯被不斷輸送進(jìn)來的胃液稀釋。在消化進(jìn)行到120 min時，從顯微鏡圖中幾乎已觀察不到MNPs。

b-0 min;c-10 min;d-20 min;e-30 min;f-60 min;g-90 min;h-120 min圖3 不同時期胃內(nèi)消化物的相機圖和光學(xué)顯微鏡圖像Fig.3 Photograph and optical microscopy images of digest in the stomach at different times注:比例尺,20 μm(下同)

2.3 金槍魚頭湯在體外仿生消化系統(tǒng)中的腸消化

2.2.1 小腸內(nèi)的pH變化

小腸在整個食物的消化吸收過程中占據(jù)著重要的地位，大分子物質(zhì)在小腸中被徹底分解成小分子，隨之被吸收。根據(jù)食物的性質(zhì)不同，在小腸中的停留時間也不同，一般是3～8 h。胰液中的消化酶和膽汁在小腸消化過程中發(fā)揮著重要作用，其最適pH一般為7.0左右[20]，這也是靜態(tài)實驗簡單的將小腸內(nèi)的pH定為7.0或7.2的原因。為使小腸內(nèi)的pH環(huán)境符合體內(nèi)數(shù)據(jù)，在設(shè)備運行一開始就以0.9 mL/min的速度勻速向小腸內(nèi)輸送小腸液，使得在食糜進(jìn)入小腸時，有適宜的pH環(huán)境。

圖4為體外仿生消化系統(tǒng)在模擬小腸消化金槍魚頭湯過程中pH的變化。在小腸消化過程中，0 min的消化物是指在胃消化進(jìn)行到6 min，通過胃排空由十二指腸進(jìn)入小腸內(nèi)的消化物。因此,小腸消化的起始pH接近于胃消化10 min時記錄的pH 5.8，因為食糜剛進(jìn)入小腸，還來不及與腸液發(fā)生中和且小腸中腸液數(shù)量有限。從圖4可知，魚湯在進(jìn)入小腸進(jìn)行消化的過程中，pH值從5.8(0 min)逐漸上升到6.9(30 min)，且在30 min后維持在6.9左右。符合人體小腸的消化環(huán)境，這也表明通過運動參數(shù)的調(diào)節(jié)，體外仿生消化系統(tǒng)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確反映動態(tài)腸消化。

圖4 不同時期小腸內(nèi)的pHFig.4 pH in the small intestine at different times

2.2.2 小腸內(nèi)MNPs的微觀結(jié)構(gòu)變化

用數(shù)碼相機對不同時期小腸內(nèi)的消化物進(jìn)行記錄(圖5-a)，觀察其外觀的變化，用光學(xué)顯微鏡觀察魚湯中MNPs的微觀結(jié)構(gòu)變化(圖5-b～圖5-h)。由圖5-a可知，隨著小腸消化時間的延長，消化物的顏色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕c腸液類似的淡黃色，這與腸液的稀釋有關(guān)。

b-30 min;c-60 min;d-90 min;e-120 min;f-150 min;g-180 min;h-210 min;i-240 min圖5 不同時期小腸內(nèi)消化物的相機圖和光學(xué)顯微鏡圖像Fig.5 Photograph and optical microscopy images of digest in the small intestine at different times

由圖5-b～圖5-h可知，消化30 min開始，大粒徑的脂質(zhì)聚集體開始裂解，中間出現(xiàn)間隙，消化進(jìn)行到60 min時大脂滴旁邊出現(xiàn)了明顯的完整的球形顆粒，這與姚云平等[24]研究發(fā)現(xiàn)牛乳經(jīng)過1 h的腸液消化后，可以觀察到中間有空隙的邊緣完整的脂肪球顆粒一致。胃中聚集的大顆粒在小腸中開始裂解的原因可能有2方面：一是由于膽汁的乳化作用，膽鹽的加入使得脂肪的表面張力降低，使脂肪球乳化成小的液滴[20]；二是由于在模擬小腸的動態(tài)消化過程中，機械力的擠壓，使得MNPs破散開。在消化時間為210 min時，光學(xué)顯微鏡圖中已經(jīng)觀察不到明顯的球形顆粒，但還可以觀察到一些點狀物，可能是由于脂肪還未被完全降解，或者可能來源于加入到腸液中的膽鹽、磷脂和脂肪酸等形成的膠束。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化體外仿生消化系統(tǒng)的運動參數(shù)探究了金槍魚頭湯在動態(tài)胃腸道消化過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明， 通過優(yōu)化設(shè)備的運行參數(shù)，可以使體外仿生消化系統(tǒng)準(zhǔn)確反映動態(tài)胃腸道消化過程。金槍魚頭湯在體外仿生消化系統(tǒng)的胃消化過程中，MNPs膜上蛋白質(zhì)降解，膜破裂，MNPs發(fā)生聚集性行為，并在消化進(jìn)行到30 min時重新形成規(guī)則的球形，到120 min時，MNPs消失，胃消化結(jié)束。同時，在胃中形成的大粒徑聚集體通過胃排空進(jìn)入小腸后，開始發(fā)生裂解，當(dāng)消化到60 min時形成了粒徑較小的完整的球形顆粒并在210 min時消失。