王寶石，譚鳳玲，李光耀，陳艷艷，馬世航，張明霞，孟麗，邱立友

1(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 新鄉(xiāng)，453003)2(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科技學(xué)院，河南 鄭州，450002)

淀粉是儲存在植物中最豐富的天然碳水化合物之一，具有來源廣泛、可再生、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[1]，是微生物生長的重要碳源。但傳統(tǒng)高溫液化模式存在能耗高且易產(chǎn)生抑制物等缺陷，長期制約著生物煉制行業(yè)的技術(shù)提升[2]。近年來，超聲波在食品物理和工業(yè)生物技術(shù)加工方面取得廣泛應(yīng)用[3]。超聲波具有綠色節(jié)能、傳質(zhì)高效的特征，促進(jìn)了淀粉改性及其輔助酶解的創(chuàng)新發(fā)展，有效規(guī)避了淀粉傳統(tǒng)高溫液化方式的缺陷。

1 超聲波技術(shù)在淀粉改性中的應(yīng)用

為適應(yīng)生物煉制中淀粉轉(zhuǎn)糖的高效、節(jié)能加工需求，國內(nèi)外研究者針對淀粉改性手段進(jìn)行了富有意義的探索，一直致力于改善生物煉制過程中淀粉糖的轉(zhuǎn)化過程，指出生物煉制中降低能量消耗，關(guān)鍵是改善淀粉至葡萄糖過程中分子解聚工藝。如在燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)中，此過程能量消耗占整個(gè)工藝的10%～20%。近年來，超聲波對食品工業(yè)中的活性物質(zhì)提取與大分子解聚過程都有積極的影響，超聲波技術(shù)具有工藝簡單、效率高、排放低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為淀粉改性領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(表1)。LI等[4]利用超聲(40 kHz，40 ℃，480 W，30 min)改性玉米淀粉，導(dǎo)致相對結(jié)晶度降低，偏光十字減小甚至消失，顯著縮短淀粉液化時(shí)間，淀粉晶體類型呈現(xiàn)A-型晶型；CHEN等[5]發(fā)現(xiàn)，超聲波不能改變淀粉的晶體類型，但能使反應(yīng)體系分散，表面積增大，提高后續(xù)酶解反應(yīng)效率。超聲波處理降低了馬鈴薯、小米和糯玉米淀粉的峰值黏度。較低的黏度可能歸因于物理損傷的淀粉顆粒，增加了水化的透水性。此外，超聲處理過程中的機(jī)械振蕩和空化會導(dǎo)致長鏈斷裂，降低淀粉顆粒間的相互作用力，從而導(dǎo)致黏度降低[6]。然而，超聲處理的大米淀粉的峰值黏度卻呈現(xiàn)相反的趨勢，顯示出比天然樣品更高的值。超聲波處理對黏度特性的影響可能取決于淀粉的類型。

超聲波處理甘薯淀粉增加了淀粉顆粒崩解的敏感性，并造成高剪切力和溫度抵抗力的減弱[7]。JIN等[8]超聲預(yù)處理(20 kHz，30 ℃，15 min)甘薯淀粉，采用同步液化及糖化方式，淀粉酶解轉(zhuǎn)化率提高了56.4%。PARK等[9]研究了室溫(25 ℃，30 min)和較高溫度(50 ℃，60 min)條件下超聲處理糙米，發(fā)現(xiàn)較長的浸泡時(shí)間均可使超聲處理淀粉的晶體結(jié)構(gòu)變得更加均勻，淀粉的熔融焓和相對結(jié)晶度均顯著降低，但仍保持A-型晶型。低功率超聲波處理淀粉的回生率有所下降，這主要是由于浸出的直鏈淀粉和長鏈支鏈淀粉的降解和解聚所引起的，對小麥粉、豌豆和豌豆淀粉的研究也得出了類似的結(jié)論[10]。此外，超聲波改性淀粉會影響淀粉溶解度，而超聲波處理使淀粉的溶解度增加了1倍以上，其機(jī)理可以描述為超聲波通過疏松淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)使其降解，使水更容易進(jìn)入網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。淀粉的溶解度跟分子質(zhì)量有關(guān)系，超聲波處理能有效降低淀粉的分子質(zhì)量，從而改善淀粉在水中的溶解度[11]。綜上所述，由于超聲空化引起的自由基和機(jī)械效應(yīng)，超聲波可以解聚淀粉聚合物分子。超聲空化是液體中的微氣核空化泡暴露在超聲場中的一系列動態(tài)過程?？栈窃趬毫档蜁r(shí)形成充滿氣體或水蒸氣的空腔，當(dāng)壓力再次升高時(shí)空化就會坍塌，會出現(xiàn)熱點(diǎn)，形成高溫壓力區(qū)，并伴有強(qiáng)烈的沖擊波和微射流。同時(shí)，在超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生的高溫、高壓作用下，水分子在熱點(diǎn)達(dá)到臨界狀態(tài)并發(fā)生裂解，在沖擊波和微射流的作用下，使羥基自由基擴(kuò)散并進(jìn)入整個(gè)超聲體系中，從而發(fā)生機(jī)械效應(yīng)和自由基效應(yīng)。相應(yīng)地，超聲波處理使淀粉分子質(zhì)量進(jìn)一步降低。超聲輻照改變了淀粉的熱性能，溶解度和糊化性能，更有利于糖化酶進(jìn)一步水解淀粉。

表1 超聲波處理對不同類型淀粉改性的研究Table 1 Modification of ultrasonic treatment on different starch

2 超聲波預(yù)處理對淀粉多尺度結(jié)構(gòu)的影響

淀粉形態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致溶脹、糊化、流變和其他物理化學(xué)屬性的改變[16]。超聲波預(yù)處理對淀粉顆粒形貌及結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響，改變淀粉理化特性，有利于淀粉后續(xù)水解過程。普遍認(rèn)為，經(jīng)過超聲波處理后，不同來源的淀粉顆粒表面會出現(xiàn)明顯的裂縫和氣孔[17]。但超聲波處理對不同淀粉顆粒大小影響不同，馬鈴薯和糯玉米淀粉的顆粒尺寸減小；而對燕麥，玉米和糯米淀粉的顆粒尺寸的影響很小[18]。淀粉顆粒破壞程度受到以下因素影響包括淀粉懸浮液的濃度、體系溫度和介質(zhì)類型、淀粉組成和類型以及超聲波處理的功率、頻率和時(shí)間[14]。YANG等[12]也發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理(150、300、450、600 W，25 ℃，20 min)對大米淀粉顆粒的非晶態(tài)區(qū)有輕微破壞，但對支鏈淀粉的鏈長分布影響不大。淀粉顆粒的無定形區(qū)域比結(jié)晶區(qū)域更容易被超聲波破壞，超聲波處理對晶體圖案類型幾乎沒有影響，淀粉樣品均呈現(xiàn)典型的A型晶型[13]。FALSAFI等[19]使用超聲浴的輻照處理降低了燕麥淀粉的結(jié)晶度，而未觀察到對XRD峰位的顯著影響；朱杰等[20]運(yùn)用小角X射線散射研究超聲處理淀粉內(nèi)部半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒內(nèi)層狀結(jié)構(gòu)中電子密度差異減小，而直鏈無定形背景區(qū)和支鏈無定形層的電子密度差異變大，且此現(xiàn)象隨著超聲強(qiáng)度增加而更加明顯。超聲波處理破壞了小麥淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小麥淀粉聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的無序化程度加深，且無序化程度隨著超聲時(shí)間延長而趨勢愈加明顯[3]。此外，分子質(zhì)量是研究淀粉分子結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)參數(shù)之一，直接影響淀粉的物化性質(zhì)。超聲波可以降解來自不同植物學(xué)來源的淀粉鏈，能夠顯著影響淀粉分子結(jié)構(gòu)和流變性能[21]。超聲波處理可降低淀粉的分子質(zhì)量，引起結(jié)構(gòu)紊亂和微觀結(jié)構(gòu)變化，扭曲淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)域，并降低糊化焓[22]。超聲誘導(dǎo)淀粉鏈斷裂導(dǎo)致分子質(zhì)量降低，降解過程歸因于產(chǎn)生局部高壓、高溫和剪切力的空化作用，從而導(dǎo)致淀粉鏈斷裂。由此產(chǎn)生的淀粉糊精具有更小的分子尺寸和更窄的分子質(zhì)量分布[16]。超聲波降解淀粉的分子質(zhì)量有一定限度，當(dāng)?shù)矸蹣悠返姆肿淤|(zhì)量接近極限值時(shí)，超聲效應(yīng)減弱。與電離輻射引起的分子質(zhì)量變化相比，超聲對淀粉分子質(zhì)量降低的貢獻(xiàn)更大。由于作用在聚合物分子上的機(jī)械應(yīng)力，超聲波會導(dǎo)致鏈斷裂，優(yōu)先地在鏈的中點(diǎn)附近斷裂聚合物鏈[23]。而糖化酶通過從鏈末端逐步分裂葡萄糖單位來攻擊淀粉分子。在酶反應(yīng)的初始階段，分子質(zhì)量變化不大。超聲波降解淀粉，能造成淀粉粒表面出現(xiàn)坑洞，分子質(zhì)量分布趨于減小，黏度等性質(zhì)發(fā)生變化[24]，超聲波輔助酶解反應(yīng)對淀粉性質(zhì)有較大的影響，超聲波處理使淀粉分子質(zhì)量進(jìn)一步降低，增強(qiáng)了糖化酶對淀粉的降解作用。

糖化酶在淀粉水解中的作用模式受到淀粉性質(zhì)的影響如溶解度、分子質(zhì)量、大小、支化度、取代基和側(cè)鏈分布[25]。在一定強(qiáng)度范圍內(nèi)，超聲波預(yù)處理淀粉可以加速淀粉的液化和糖化，提高酶解反應(yīng)的速率常數(shù)[4]。超聲波能有效破壞淀粉團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，破壞淀粉鏈，降低淀粉分子質(zhì)量[26]。增加了相互纏繞的聚集體中的游離可移動淀粉片段，暴露了更多與酶接觸的部位。淀粉鏈的斷裂歸因于局部高壓、高溫和聲空化產(chǎn)生的剪切力[16]。超聲波在底物上產(chǎn)生的上述結(jié)構(gòu)變化是提高底物對酶可及性的原因[27]。通過破壞淀粉結(jié)構(gòu)，超聲波可以降低淀粉分散體的黏度[28]。黏度降低導(dǎo)致超聲強(qiáng)度衰減較弱，傳遞到反應(yīng)體系的能量較多，從而促進(jìn)了反應(yīng)物的混合。因此，超聲波預(yù)處理淀粉為反應(yīng)體系提供了更好的混合條件，并使生成的淀粉片段更容易到達(dá)糖化酶的作用位點(diǎn)，最終加快了酶解反應(yīng)過程。

3 超聲波耦合酶解反應(yīng)過程的生物學(xué)效應(yīng)

3.1 溫和超聲波條件對酶活性的影響

近年來，超聲波已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和食品領(lǐng)域，但很少在生物效應(yīng)方面如對微生物細(xì)胞增殖的加速效應(yīng)、微生物的滅活效應(yīng)以及酶活性的影響等方面進(jìn)行研究[29]。研究人員多致力于超聲波對酶活性的滅活研究[29]，只有很少的關(guān)于超聲可以改善酶的活性報(bào)道。最近有報(bào)道稱，在較溫和的條件下，超聲并不能使所有的酶失活，也可能會使其活躍。低頻和強(qiáng)度較弱的超聲波通過產(chǎn)生瞬態(tài)來工作空化效應(yīng)，形成自由基和機(jī)械效應(yīng)[30]。形成的聲效應(yīng)直接改變了酶的結(jié)構(gòu)，使其更容易與底物發(fā)生反應(yīng)。因此，協(xié)同超聲波的作用和酶的催化活性使其成為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛在選擇。WANG等[31]探討了超聲波對纖維素酶活性的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲(15 W，24 kHz，10 min)處理后，游離纖維素酶活性最高，酶活力比對照提高18.2%。超聲波處理使纖維素酶表面色氨酸數(shù)量略有增加，纖維素酶蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生一定數(shù)量的變形，隨機(jī)螺旋含量增加[31]；同時(shí)，LADOLE等[32]超聲(24 kHz，6 W和6 min)處理固定在磁性納米粒子上的纖維素酶，固定化纖維素酶的催化活性比對照提高了近3.6倍，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)纖維素酶構(gòu)象發(fā)生變化是導(dǎo)致超聲后活性增強(qiáng)的原因；YADAV等[33]采用低頻超聲輻射枯草芽孢桿菌ABDR01，改善了其營養(yǎng)吸收率以及細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶的協(xié)同生產(chǎn)；BHALERAO等[34]研究發(fā)現(xiàn),固定化脂肪酶能承受超聲波作用并提高了轉(zhuǎn)化率，指出超聲耦合攪拌是一種潛在強(qiáng)化大豆油化學(xué)酶轉(zhuǎn)化的方法；JADHAV等[35]研究了探針型超聲儀超聲對脂肪酶活性的影響，經(jīng)超聲處理后(超聲強(qiáng)度12.22 W/cm2，9 min)脂肪酶活性增加2倍，同時(shí)脂肪酶熱力學(xué)參數(shù)(ΔG、ΔS、ΔH和ΔE)顯著降低[35]。綜述所述，超聲波在溫和條件下耦合酶解不會使酶失活反而能夠改善酶活性，能夠呈現(xiàn)正向的生物學(xué)效應(yīng)。

3.2 超聲波耦合淀粉酶解過程對糖化酶活性的影響

超聲波會改變酶的構(gòu)象，同樣會引起糖化酶的修飾，導(dǎo)致酶活性發(fā)生有利變化，從而加速反應(yīng)。MENG等[36]探討了超聲波處理對葡萄糖淀粉酶酶活性的影響，在60 ℃，420 W，10 min超聲波條件下，酶活力較對照組提高21.1%，超聲波處理后葡萄糖淀粉酶表面色氨酸和酪氨酸的數(shù)量增加，α-螺旋和無規(guī)卷曲分別增加了17.8%和12.4%。因此，適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢约せ钇咸烟堑矸勖富钚?，但活性較高超聲功率對酶活性有抑制作用。在較高溫度下，酶分子運(yùn)動增加，分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn)，超聲溫度為60 ℃時(shí)，糖化酶活力提高22.10%，糖化酶活性易受溫度變化的影響，超聲空化作用與反應(yīng)溫度有關(guān)，也會阻礙超聲空化作用[37]。超聲波未改變糖化酶最適反應(yīng)溫度，但高溫極端條件下加速了糖化酶的熱滅活，破壞多肽鏈上的分子間相互作用來影響酶的穩(wěn)定性并使某些酶失活，由于熱滅活和超聲波滅活共同作用的結(jié)果。高溫會破壞酶分子的中心結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，增加體系的平衡蒸汽壓，更容易形成氣泡，使酶分子的行為發(fā)生改變[38]。在高溫、高超聲功率和長時(shí)間處理下，超聲導(dǎo)致酶失活，尤其是在超過65 ℃的高溫條件下。同時(shí)，在65 ℃以下對混合酶反應(yīng)體系進(jìn)行超聲處理，可顯著促進(jìn)淀粉水解；與超聲預(yù)處理相比，超聲波耦合酶解反應(yīng)過程處理，通過超聲波可以部分克服這種阻塞促進(jìn)分子運(yùn)動，促進(jìn)整個(gè)淀粉酶促反應(yīng)體系，使得淀粉水解效率提升5倍以上[39]。此外，生物大分子的流變行為與反應(yīng)溫度相對應(yīng)，酶的活性隨溫度的變化而變化。適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢约せ钐腔傅幕钚?，反?yīng)速率和酶-底物親和力都有所提高。但高強(qiáng)度的超聲波處理會抑制酶的活性。在適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚硐拢呋磻?yīng)更容易進(jìn)行，所以加速了糖化酶對淀粉的水解。糖化酶活性的變化可能與酶分子結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，這些變化可以為超聲耦合酶制劑的開發(fā)提供新的思路和研究基礎(chǔ)。此外，傳統(tǒng)酶解系統(tǒng)通常在內(nèi)部傳質(zhì)方面具有局限性，這可能會延遲反應(yīng)進(jìn)程。

4 展望

超聲波作為一種淀粉改性技術(shù)，具有作用時(shí)間短、降解目的性強(qiáng)、操作簡單且易控制及能耗較低等優(yōu)點(diǎn)。超聲波處理淀粉不僅可以破壞淀粉顆粒的表面形態(tài)，還可以使內(nèi)部結(jié)構(gòu)變疏松；也可以打斷淀粉顆粒中的鏈條直接降解淀粉，提高酶解的利用性。超聲波空化作用影響淀粉酶的構(gòu)象，在適當(dāng)?shù)臈l件下暴露活性部位，酶構(gòu)象的這些變化促進(jìn)了酶與底物的結(jié)合，從而提高了酶的活性。此外，超聲波由于其有效的混合效果而通常用于增強(qiáng)液-液或液-固過程。超聲波耦合酶解反應(yīng)方式融合了超聲和酶解間的協(xié)同作用，是未來淀粉綠色深加工的重要發(fā)展方向，將在工業(yè)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力。但超聲波耦合酶解反應(yīng)體系的構(gòu)建及其相關(guān)作用機(jī)理，有待進(jìn)一步深入挖掘。同時(shí)，開發(fā)面向工業(yè)化生產(chǎn)的超聲波耦合酶解設(shè)備，為淀粉加工的綠色制造和智能制造奠定基礎(chǔ)。