徐 穎，庾嘉欣，于 淼，孫廣玉

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

0 引言

土壤微生物作為土壤中的重要分解者，在森林土壤生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)與物質(zhì)循環(huán)中起著重要的調(diào)控作用[1]。土壤微生物不僅參與有機(jī)質(zhì)的分解，促進(jìn)腐殖酸的形成，還能改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物吸收，增加植物抗性，為地上植被儲(chǔ)備養(yǎng)分提供了有利條件[2]。細(xì)菌在土壤微生物總量占比中超過半數(shù)，在土壤微生物群落中具有代表意義[3]。土壤細(xì)菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動(dòng)者，可促進(jìn)土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解并使其轉(zhuǎn)化為土壤的營養(yǎng)物質(zhì)，提高土壤肥力和改善土壤環(huán)境[4]。土壤細(xì)菌與地上植物有著緊密聯(lián)系[5]，分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征有利于了解地上植物的多樣性。

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica，簡寫Ps)和黑皮油松(Pinustabulaeformis.var.mukdensis，簡寫Pt)均為松科植物，是我國三北地區(qū)主要優(yōu)良造林樹種[6]，因其耐嚴(yán)寒、抗干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、觀賞性高、抗病蟲害和防風(fēng)固沙能力強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛栽培[7]，是我國重要的防護(hù)造林和園林綠化樹種。其中，樟子松和黑皮油松的松針還富含多種活性成分及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[8]，具有抗腫瘤、抗氧化等多重藥理活性[9]。近些年，國內(nèi)外學(xué)者對樟子松和黑皮油松人工林的研究大多集中于地上部分的撫育技術(shù)、生長規(guī)律、水分利用、林分結(jié)構(gòu)和營造技術(shù)等方面[10]。李日勝等[11]介紹了油松和樟子松的容器育苗技術(shù)，可降低成本，提高造林成活率。白結(jié)冰等[12]對油松和樟子松的抗旱水分生理進(jìn)行了研究，表明樟子松的抗旱性要優(yōu)于油松。李國華等[13]比較了木蘭圍場陡坡地段兩種林分的生長狀況和造林成效，其中油松的存活率高，樟子松人工林地徑和樹高較高，該環(huán)境更有利于樟子松的生長。對于地下部分，鄧?yán)^峰等[14]主要研究不同坡位對油松和樟子松人工林土壤養(yǎng)分特征和生長性狀的影響，對樟子松和黑皮油松人工林土壤微生物研究較少。為進(jìn)一步了解樟子松和黑皮油松人工林細(xì)菌群落，比較樟子松和黑皮油松細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)差異，利用高通量測序技術(shù)對樟子松和黑皮油松人工林土壤細(xì)菌群落進(jìn)行研究與分析，以期為人工林培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地(45°43′10″N，126°37′15″E)，海拔136～140 m。哈爾濱市北鄰小興安嶺山區(qū)，東南靠張廣才嶺支脈丘陵，中部有松花江流經(jīng)，山勢不高，平原遼闊，屬溫帶季風(fēng)性氣候，四季分明，冬季漫長寒冷，夏季短暫涼爽，1月份最冷，平均溫度-13.1℃～-24.6℃，7月份最熱，平均溫度18.3℃～22.7℃，無霜期一般為136 d[15]。

1.2 樣品采集與處理

從哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范研究基地選取樟子松和黑皮油松人工林樣地采集土樣(避免雨季)。按5點(diǎn)法在每個(gè)樣地用土鉆距離根基10 cm、深度為0～10 cm進(jìn)行取樣，除去雜物后，進(jìn)行充分混合，過2 mm的篩，作為1個(gè)根區(qū)的土壤樣品，共獲得6個(gè)樣品(2種林型×3個(gè)重復(fù)樣本)，于-20 ℃冷凍保存，用于提取DNA。在采集土壤樣品前，去除地表的枯枝落葉。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物總DNA提取

采用DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進(jìn)行檢測。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及測序

樣品總DNA提取后，以微生物總DNA為模板，以細(xì)菌V3+V4區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用Illumina MiSeq測序平臺(tái)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序分析，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測序數(shù)據(jù)通過軟件進(jìn)行過濾優(yōu)化和雙端序列的連接，優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，獲得OTU統(tǒng)計(jì)豐度信息。根據(jù)Silva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋和分類，確定序列的分類信息，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。基于OTU豐度信息，利用R語言工具繪圖，利用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性，利用Excel 2010和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌DNA測序數(shù)據(jù)分析

通過Veen圖(圖1)可知，在97%相似水平上，Ps和Pt細(xì)菌群落中共有OTU數(shù)量為2 138個(gè)，特有OTU數(shù)量分別為253和584個(gè)。將序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所代表的 OTU 數(shù)目構(gòu)建Rarefaction曲線(圖2)，Rarefaction曲線反映了樣品文庫測序數(shù)據(jù)量的合理性，可用于評價(jià)測序數(shù)據(jù)能否覆蓋所有類群。通過Ps和Pt人工林土樣的細(xì)菌Rarefaction曲線可知，隨著測序數(shù)量的增大，其所對應(yīng)OTU的數(shù)目增加，各土樣的曲線均呈先上升后趨于平緩的趨勢。同時(shí)各土樣的細(xì)菌Coverage指數(shù)均高達(dá)98%以上(表1)，說明本研究樣品文庫測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣本中微生物的真實(shí)情況。

圖1 土壤樣品細(xì)菌群落OTU分布的Veen圖Fig.1 Veen map of OTU distribution of bacteria communities in soil samples Ps:樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica)；Pt:黑皮油松(Pinus tabulaeformis.var.mukdensis) 下同 The same below

圖2 土壤樣品細(xì)菌群落的稀釋曲線Fig.2 Attenuation curves of bacterial communities in soil samples

表1 土壤樣品細(xì)菌群落豐度和多樣性指數(shù)Tab.1 Community richness and diversity index of bacterial in soil samples

2.2 土壤樣品細(xì)菌群落豐度及多樣性

Shannon指數(shù)評估物種的多樣性，數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。ACE 和Chao指數(shù)評估物種的豐富度。由表1可知，在97%分類水平下，Ps和Pt土壤細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)分別為6.19和6.52，Pt土壤樣品ACE和Chao指數(shù)顯著高于Ps ，說明Ps和Pt土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，Pt比Ps土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度更高。

2.3 土樣樣品群落組成分析

圖3展示了細(xì)菌在門水平上相對豐度>1%的物種組成，相對豐度<1%計(jì)為其他(other)。2種人工林土樣細(xì)菌群落共聚類32個(gè)門，76個(gè)綱，149個(gè)目，277個(gè)科，445個(gè)屬，972個(gè)種。其中Ps和Pt土樣細(xì)菌群落在門水平上主要分為：Proteobacteria(變形菌門)(39.32%，33.55%)、Acidobacteria(酸桿菌門)(27.06%，24.54%)、Actinobacteria(放線菌門)(10.63%,12.72%)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)(4.52%，5.03%)、Bacteroidetes(擬桿菌門)(5.00%，4.33%)、Chlorofleixi(綠彎菌門)(3.75%，5.38%)、Verrucomicrobia(疣微菌門)(2.42%，4.24%)、Saccharibacteria(2.03%，3.13%)、Parcubacteria(0.89%，1.40%)和Nitrospirae(硝化螺旋菌門)(0.83%，1.15%)。其中：Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)為優(yōu)勢門，其總相對豐度在Ps和Pt土樣中分別高達(dá)77.01%和70.81%。

圖3 土壤樣品在門水平上細(xì)菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities in soil samples at phylum level

由圖4和圖5可知，2種人工林土樣在屬水平上的細(xì)菌群落相對豐度明顯不同。Ps相對豐度排名前3的是norank-f--Acidobacteriaceae--Subgroup-1-、Rhizomicrobium和Bryobacter，Pt相對豐度排名前3的是norank-f--Acidobacteriaceae-Subgroup-1-、norank-c-Acidobacteria、RB41。Ps和Pt的主要優(yōu)勢屬均為norank-f-Acidobacteriaceae--Subgroup-1-，相對豐度分別為7.76%和4.80%。Rhizomicrobium是Ps第二優(yōu)勢屬，相對豐度為6.22%，但在Pt中僅占3.68%。RB41是Pt第三優(yōu)勢屬，相對豐度為3.89%，但在Ps中沒有顯示豐度值。根據(jù)物種聚類數(shù)可知(圖6)，將土壤16SrDNA細(xì)菌Heat map圖劃分為7個(gè)Cluster，Ps相對豐度前10的屬在Cluster5和Cluster7，Pt相對豐度前10的屬在Cluster5、Cluster6和Cluster7。Cluster6的主要屬為RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group，故Cluster6的主要屬可能是影響Ps和Pt的差異屬。

圖4 樟子松土壤樣品在屬水平上細(xì)菌群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities in Ps soil sample at genus level

圖5 黑皮油松土壤樣品在屬水平上細(xì)菌群落相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial communities in Pt soil sample at genus level

3 討論與結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)分析了樟子松和黑皮油松土壤細(xì)菌群落組成和多樣性。結(jié)果顯示，不同人工林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。黑皮油松人工林土壤樣品細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均顯著高于樟子松。有研究表明，植被類型是影響土壤微生物多樣性的重要因素之一[16]，不同植被類型的樹木。通過其凋落物的分解，養(yǎng)分回歸到土壤中，為土壤微生物提供主要營養(yǎng)物質(zhì)[17]。而土壤凋落物和根系分泌物不同，土壤的養(yǎng)分、含水量和酸堿度等因素也會(huì)有所不同，從而導(dǎo)致土壤微生物多樣性存在較大差異[18]。在本試驗(yàn)中，黑皮油松人工林土壤樣品采集地樹種較為豐富，而樟子松人工林植被較單一，地上植被物種組成的多樣性，是黑皮油松土壤細(xì)菌多樣性和豐富度較高的原因之一。在土壤養(yǎng)分方面，黑皮油松人工林有黑皮油松、水曲柳、黃檗和榆樹等植物，土壤凋落物豐富，有助于土壤養(yǎng)分循環(huán)利用，促進(jìn)土壤微生物繁殖，使細(xì)菌群落較豐富；而樟子松人工林植被單一，凋落物較少，土壤養(yǎng)分匱乏，不利于土壤微生物的繁殖生長[19]。土壤含水量同樣影響土壤細(xì)菌的多樣性。唐菊秀等[20]研究表明油松持水力也高于樟子松，黑皮油松人工林土壤含水量相對較高。本試驗(yàn)中，黑皮油松人工林的林分郁閉度較大，土壤水分不易蒸發(fā)，土壤含水量較高；而樟子松人工林的林分郁閉度較小，土壤含水量較低。研究表明，土壤細(xì)菌在獲取養(yǎng)分過程中，更依賴于水膜的流動(dòng)[15]，因此水分含量較高的黑皮油松人工林土壤細(xì)菌更容易獲取養(yǎng)分，更有利于細(xì)菌的生長和繁殖。在土壤酸堿度方面，黑皮油松人工林土壤pH值低于樟子松人工林[21]，可能導(dǎo)致了其細(xì)菌群落的多樣性差異，因此黑皮油松人工林土壤微生物細(xì)菌群落具有較高的多樣性和豐富度。

在門分類水平上，樟子松和黑皮油松人工林排名前十的門沒有差異，主要優(yōu)勢門均為Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria，這與前人研究表明的東北黑土區(qū)主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成一致[22]。樟子松和黑皮油松人工林在屬水平上的細(xì)菌群落相對豐度明顯不同，RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group可能是影響樟子松和黑皮油松人工林差異的關(guān)鍵屬。其中，Sphingomonas能夠提高植物抗逆性，被視為植物益生菌，有利于植物的生長繁殖[23]。本研究中鞘氨醇單胞菌屬是黑皮油松人工林優(yōu)勢屬，進(jìn)一步證實(shí)了黑皮油松和樟子松人工林土壤環(huán)境和凋落物的不同，導(dǎo)致其土壤內(nèi)部生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)產(chǎn)生差異，影響微生物對養(yǎng)分的吸收與利用，可能是引起土壤細(xì)菌群落在屬水平上有較大差異的原因。

綜上所述，黑皮油松人工林土壤細(xì)菌群落具有較高的多樣性和豐富度；樟子松和黑皮油松人工林土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢門一致；樟子松人工林和黑皮油松人工林土壤細(xì)菌群落屬水平差異大；RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group是導(dǎo)致樟子松和黑皮油松人工林差異的關(guān)鍵屬，后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。