余曉燕 余佳龍 馮立峰 童飛鵬

(1.杭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，浙江 杭州 310018；2.浙江環(huán)茂自控科技有限公司，浙江 杭州 311121；3.杭州市生態(tài)環(huán)境局錢塘新區(qū)分局，浙江 杭州 311225)

當(dāng)前，場地地下水的污染調(diào)查診斷主要是對(duì)地下水中部分污染物含量的化學(xué)分析，由于場地污染的復(fù)雜性，很多情況下化學(xué)診斷并不能全面反映場地受污染的情況及各種有毒有害物質(zhì)對(duì)周邊環(huán)境或生物的綜合影響，生物毒性診斷技術(shù)可以彌補(bǔ)這一缺陷。周艷等[1]700對(duì)某有機(jī)污染場地淺層地下水的生物毒性研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)靈敏度高于成魚急性毒性試驗(yàn)，可用于污染場地水樣毒性的快速診斷。王超等[2]利用蠶豆根系細(xì)胞微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自來水出廠水潛在致突變性較原水強(qiáng)，主要原因?yàn)榛瘜W(xué)消毒劑與水源水中有機(jī)物形成了一系列低濃度但具有致突變性的消毒副產(chǎn)物。宋曉威等[3]選擇大型蚤、斜生柵藻、發(fā)光菌為試驗(yàn)生物，對(duì)某廢棄農(nóng)藥廠污染場地不同區(qū)域淺層地下水進(jìn)行了化學(xué)和生物毒性分析，發(fā)現(xiàn)毒性試驗(yàn)結(jié)果與化學(xué)檢測結(jié)果有較好的相關(guān)性，3種受試生物的毒性效應(yīng)結(jié)果一致。針對(duì)污染場地或潛在污染場地，現(xiàn)有的研究認(rèn)為生物毒性診斷技術(shù)是化學(xué)診斷的有益補(bǔ)充[4-6]。但必須指出的是，作為一項(xiàng)應(yīng)用于場地污染識(shí)別的實(shí)用技術(shù)，它應(yīng)同時(shí)具備以下特征：有國際或國家標(biāo)準(zhǔn)支撐，易于操作，耗費(fèi)較低。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織制定了針對(duì)化學(xué)品生物毒性效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)與工作指南[7]，我國于20世紀(jì)90年代參照國際標(biāo)準(zhǔn)也已制定了蚤類(大型蚤)、發(fā)光細(xì)菌等水質(zhì)急性毒性測定方法[8-9]，在2019年頒布了測定水質(zhì)急性毒性的斑馬魚卵法[10]。

本研究涉及的兩家在產(chǎn)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)廠區(qū)土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粉土，土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.1%～0.4%，一旦土壤被污染，地下水極易受到影響。本研究以廠區(qū)淺層地下水為研究對(duì)象，采用發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)和斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)初步診斷場地淺層地下水的生物毒性，以期為在產(chǎn)企業(yè)的危害識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及污染防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究區(qū)域?yàn)橄噜彽?家農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)，企業(yè)A主要生產(chǎn)氟蟲腈和乙蟲腈，企業(yè)B主要生產(chǎn)炔螨特、氟節(jié)胺、丁硫克百威等，均位于杭州。由場地調(diào)查取樣專業(yè)公司采用美國Geoprobe Direct Push取樣系統(tǒng)，根據(jù)美國材料與測試協(xié)會(huì)(ASTM)制定的相關(guān)技術(shù)導(dǎo)則進(jìn)行操作并建井。企業(yè)A在靠近合成區(qū)域、焚燒爐、罐區(qū)、制劑車間的地方各設(shè)一口監(jiān)測井，分別標(biāo)為A01、A02、A03、A04，企業(yè)B在靠近兩個(gè)合成車間生產(chǎn)區(qū)域的地方各設(shè)一口監(jiān)測井，分別標(biāo)為B01、B02(見圖1)。A01建井深度8 m，其余均為6 m。洗井后采樣，用于化學(xué)分析以及生物毒性診斷。現(xiàn)場觀察A04地下水有氣泡，B01地下水有刺激性氣味。地下水埋深較淺，采樣期間地下水埋深為0.65～1.14 m，屬第四系潛水類型。

1.2 生物毒性診斷

發(fā)光細(xì)菌急性毒性診斷參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，發(fā)光細(xì)菌凍干粉購自中科院南京土壤研究所，采用30 min的暴露時(shí)間。生物毒性分為4級(jí)：Ⅰ級(jí)(低毒或無毒)，原樣抑制率低于30%為無毒，抑制率30%～50%為低毒；Ⅱ級(jí)(中等毒性)，原樣抑制率高于50%，原樣稀釋10倍后，抑制率低于50%；Ⅲ級(jí)(高毒)，原樣稀釋10倍后，抑制率高于50%，但稀釋100倍后抑制率低于50%；Ⅳ級(jí)(強(qiáng)毒性)，原樣稀釋100倍后抑制率仍高于50%。

斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。挑選發(fā)育正常的受精卵在2.5～3.0 h(囊胚期初期)進(jìn)行暴露試驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)板中開展試驗(yàn)，每孔加入2 mL水樣和1枚隨機(jī)選取的正常受精卵，(26±1) ℃下，每天按照14 h光照加10 h非光照的周期培養(yǎng)，每隔24 h更換一半水樣，每個(gè)處理15孔，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用4種指標(biāo)表征胚胎毒性：(1)胚胎孵化率，選擇24、48、72 h孵化率指標(biāo)；(2)胚胎死亡率，選擇24、48、72 h死亡率指標(biāo)；(3)幼魚存活率，胚胎染毒96 h后統(tǒng)計(jì)存活數(shù)在孵化數(shù)中的比例，表征幼魚期急性毒性；(4)幼魚致畸率，胚胎染毒96 h后統(tǒng)計(jì)致畸數(shù)(不包括死亡幼魚)在孵化數(shù)中的比例，致畸指標(biāo)包括心包囊腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲，由于本次試驗(yàn)心包囊腫出現(xiàn)頻率高，以該指標(biāo)作為致畸評(píng)價(jià)指標(biāo)。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 The distribution of sampling sites

1.3 化學(xué)分析

地下水揮發(fā)性有機(jī)物測定參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，半揮發(fā)性物質(zhì)、耗氧量、氟化物、重金屬等指標(biāo)測定參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。特征污染物氟蟲腈、乙蟲腈、氟節(jié)胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威采用C18富集，液相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜法進(jìn)行分析。由于A04和B01水樣被診斷為具備生物毒性，但化學(xué)分析未能明確污染物質(zhì)，于是將A04和B01水樣進(jìn)行進(jìn)一步定性檢測，A04水樣真空濃縮10倍，采用高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS)進(jìn)行分析，B01水樣用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10，乙酸乙酯萃取兩次，氣相色譜—質(zhì)譜分析。

表1 地下水化學(xué)分析結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 地下水化學(xué)分析

杭州地區(qū)對(duì)地下水沒有明確分類，但在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中一般要求執(zhí)行《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 14848—2017)Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)，即地下水化學(xué)組分含量中等，適用于集中式生活飲用水水源及工農(nóng)業(yè)用水。表1為地下水分析結(jié)果。6口井地下水pH均呈中性，pH為7.06～7.34。企業(yè)A不同點(diǎn)位耗氧量差異極大，范圍為1.79～14.20 mg/L。A04(近制劑車間)和A02(近焚燒爐)的地下水耗氧量超過10 mg/L，超過GB/T 14848—2017 Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn), 超標(biāo)倍數(shù)分別為3.06和3.73，由于A02在焚燒爐影響區(qū)域，估計(jì)這口井水質(zhì)可能受焚燒爐作業(yè)影響；氟化物為0.60～1.83 mg/L，A01(近合成區(qū)域)超標(biāo)；地下水中檢出揮發(fā)性有機(jī)污染物1,2-二氯乙烷和氯苯，兩種污染物均未超標(biāo)。企業(yè)B生產(chǎn)區(qū)兩口井B01、B02耗氧量分別為2.09、7.36 mg/L，B02耗氧量超標(biāo)；氟化物分別為2.46、0.89 mg/L，B01氟化物超標(biāo)；揮發(fā)性有機(jī)污染物1,2-二氯乙烷有檢出，但未超標(biāo)。企業(yè)A的特征污染物氟蟲腈、乙蟲腈，以及企業(yè)B的特征污染物氟節(jié)胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威均未檢出。因此從地下水化學(xué)分析結(jié)果判斷，兩個(gè)在產(chǎn)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)淺層地下水質(zhì)量基本可控，但受工業(yè)生產(chǎn)影響，部分指標(biāo)超標(biāo)。

2.2 發(fā)光細(xì)菌急性毒性診斷

洗井24 h后采地下水分析，發(fā)現(xiàn)企業(yè)A地下水對(duì)發(fā)光細(xì)菌無毒；企業(yè)B兩口井差異很大，B01發(fā)光細(xì)菌抑制率達(dá)48%，低毒；B02發(fā)光細(xì)菌抑制率低于4%，無毒(見圖2)。上述現(xiàn)象說明企業(yè)B地下水存在一定量的毒性物質(zhì)， B01綜合毒性高于B02。鑒于兩個(gè)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)均存在氟化物超標(biāo)現(xiàn)象，本研究同時(shí)監(jiān)測了水樣中氟化物分別為1.00、2.00 mg/L時(shí)的發(fā)光細(xì)菌毒性，結(jié)果表明氟化物在2.00 mg/L以內(nèi)無毒。

2.3 斑馬魚胚胎及幼魚毒性分析

取A04、B01水樣進(jìn)行斑馬魚胚胎毒性分析，蒸餾水作為對(duì)照。在受精后不同時(shí)間段(24、48、72 h)觀察斑馬魚的發(fā)育變化，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組斑馬魚胚胎的孵化數(shù)、死亡數(shù)和致畸數(shù)。

圖2 地下水發(fā)光細(xì)菌急性毒性結(jié)果Fig.2 Acute toxicity of luminescent bacteria for groundwater

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

B01的24 h胚胎凝固率異常高，顯然其對(duì)胚胎具有急性毒性，A04和對(duì)照未見明顯毒害作用，說明A04對(duì)胚胎期和卵黃囊期的斑馬魚致死作用不明顯。多數(shù)斑馬魚胚胎在A04中48 h已完成孵化，但在B01和對(duì)照中暴露72 h才完成孵化。96 h時(shí)觀察胚胎孵化后的致畸數(shù)和死亡數(shù)，發(fā)現(xiàn)A04和B01中脊柱彎曲的幼魚基本死亡，B01心包囊腫出現(xiàn)頻率較高。

2.3.2 胚胎死亡率和孵化率

圖3(a)為斑馬魚胚胎死亡率對(duì)比情況，對(duì)照、A04、B01處理的斑馬魚胚胎24 h死亡率分別為0、15.56%、82.00%，存在顯著差異，且B01在24 h內(nèi)胚胎凝固率異常高，說明B01對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的早期階段影響很大，具有較強(qiáng)的急性毒性。相比之下A04對(duì)胚胎期和卵黃囊期的斑馬魚致死作用較弱，與區(qū)域?qū)φ拯c(diǎn)的胚胎死亡率差異較小(圖3中未列出，區(qū)域?qū)φ拯c(diǎn)24、48、72 h的胚胎死亡率分別為15.56%、15.56%、17.78%)。

圖3(b)為斑馬魚胚胎孵化率對(duì)比情況，對(duì)照處理72 h孵化率為100.00%；B01的72 h孵化率僅為6.67%，A04的斑馬魚胚胎48 h就已孵化，48 h孵化率達(dá)75.56%，72 h孵化率為73.33%，即A04對(duì)斑馬魚胚胎具有十分顯著的孵化促進(jìn)作用，孵化后的幼魚24 h存在死亡現(xiàn)象。

圖3 地下水對(duì)斑馬魚胚胎死亡率和孵化率的影響Fig.3 Effects of groundwater on mortality and hatching rate of zebrafish embryos

2.3.3 幼魚存活率和致畸率

對(duì)照、A04、B01處理的斑馬魚胚胎孵化數(shù)分別為15、11、1條(3組實(shí)驗(yàn)取平均值)；圖4(a)為斑馬魚幼魚存活率對(duì)比情況，對(duì)照和B01中存活率為100.00%，A04中存活率僅為30.68%。A04對(duì)斑馬魚胚胎有孵化促進(jìn)作用，但對(duì)幼魚具有毒性，而B01對(duì)斑馬魚早期胚胎致死率極高，但孵化后幼魚存活率高。

圖4(b)為斑馬魚幼魚致畸率對(duì)比情況，對(duì)照中斑馬魚幼魚未見致畸現(xiàn)象，A04中孵化的幼魚致畸率為12.87%，B01則高達(dá)100.00%。

3 討 論

從現(xiàn)場踏勘和信息反饋來看，企業(yè)A環(huán)境管理和污染控制水平優(yōu)于企業(yè)B，企業(yè)A車間布局合理，合成車間和制劑車間底層均為包裝等輕污染工序，企業(yè)B整體為鋼架結(jié)構(gòu)，反應(yīng)釜就在底層。從化學(xué)分析角度，在產(chǎn)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)地下水污染較輕，

圖4 地下水對(duì)斑馬魚幼魚致畸率和存活率的影響Fig.4 Effects of groundwater on teratogenic and survival rate of juvenile zebrafish

毒性物質(zhì)基本可控，兩家企業(yè)地下水耗氧量和氟化物指標(biāo)超標(biāo)，企業(yè)A主要檢出1,2-二氯乙烷、氯苯，企業(yè)B檢出1,2-二氯乙烷。由于在產(chǎn)企業(yè)的部分采樣點(diǎn)無法靠近生產(chǎn)區(qū)域，污染物質(zhì)濃度較低或未檢出并不能代表企業(yè)未受污染，對(duì)于在產(chǎn)企業(yè)來說，最主要的是確定有無泄漏，早發(fā)現(xiàn)，早提出對(duì)策，從而實(shí)現(xiàn)污染防控，因此從檢測手段來說，應(yīng)優(yōu)先或同時(shí)選擇幾種靈敏度高的表征方法，但目前第三方檢測機(jī)構(gòu)基本依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機(jī)污染物進(jìn)行檢測，其方法更適用于退役場地高濃度污染物的檢測，對(duì)于在產(chǎn)企業(yè)非重點(diǎn)生產(chǎn)區(qū)域低濃度污染物的檢測存在局限性。

生態(tài)毒理學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)綜合診斷方法是化學(xué)診斷方法的有益補(bǔ)充。本研究采用發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)和斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)檢測了兩個(gè)在產(chǎn)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)淺層地下水的生物毒性，結(jié)果表明兩家企業(yè)地下水均存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。企業(yè)B地下水發(fā)光細(xì)菌急性毒性呈低毒，但斑馬魚胚胎急性毒性非常強(qiáng)，24 h死亡率達(dá)82.00%，孵化出的幼魚致畸率為100.00%。企業(yè)A地下水發(fā)光細(xì)菌急性毒性為無毒，明顯促進(jìn)斑馬魚胚胎的孵化，但孵化后幼魚存活率低，僅為30.68%。上述結(jié)果表明斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)可能較發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)更為靈敏，具有可記錄多項(xiàng)毒性指標(biāo)的特點(diǎn)[1]704,[13]1092，更適用于在產(chǎn)企業(yè)地下水污染診斷，但其試驗(yàn)周期相對(duì)較長，相較之下，發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)更適用于批量試驗(yàn)，兩者聯(lián)合使用可以快速識(shí)別和篩選場地污染區(qū)域。

兩家農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)地理位置相鄰，但生物毒性反應(yīng)并不一致，說明地下水的生物毒性是農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)特征污染物所致，并不是區(qū)域共性地下水污染物引起。本研究檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)A04水樣中含一種除草劑環(huán)莠隆(C11H22N2O)，但企業(yè)否認(rèn)有該物質(zhì)，除草劑復(fù)配過程需使用表面活性劑，在采樣過程也發(fā)現(xiàn)A04水樣有氣泡(表面活性劑存在的一種表現(xiàn))。劉迎等[13]1091研究了6種常見農(nóng)藥表面活性劑對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)6種表面活性劑均誘導(dǎo)斑馬魚出現(xiàn)身體側(cè)翻、游囊關(guān)閉的現(xiàn)象。斑馬魚幼魚需要游到水面，呼吸空氣以后游囊才能張開[14]，GOOLISH等[15]認(rèn)為游囊的正常膨大對(duì)于調(diào)控魚體上浮下沉，提高取食效率非常重要。鑒于A04水樣對(duì)幼魚期斑馬魚開口攝食影響很大，初步判斷該區(qū)地下水可能受農(nóng)藥表面活性劑的影響。B01水樣檢測到毒性物質(zhì)2,4-二叔丁基酚，該物質(zhì)對(duì)斑馬魚24 h的半數(shù)致死濃度(LC50)為1.866 mg/L，屬于高毒物質(zhì)[16]。

4 結(jié) 語

調(diào)查的兩家在產(chǎn)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)淺層地下水存在生物毒性，企業(yè)A地下水發(fā)光細(xì)菌急性毒性為無毒，明顯促進(jìn)斑馬魚胚胎的孵化，但孵化后幼魚存活率低，進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)排查應(yīng)主要關(guān)注環(huán)莠隆和表面活性劑。企業(yè)B地下水發(fā)光細(xì)菌急性毒性為低毒，但斑馬魚胚胎急性毒性非常強(qiáng)，建議關(guān)注2,4-二叔丁基酚。斑馬魚胚胎急性毒性和發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)聯(lián)合使用可以快速識(shí)別和篩選場地地下水污染區(qū)域。