黎玉瓊，黃雪利，高?；?，梁小軍，王勝義，宋曉平，崔東安，趙正偉

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100）

胎衣不下指母畜在娩出胎兒后，胎衣不能在正常時(shí)間內(nèi)（一般是指超過(guò)12h）排出[1]。產(chǎn)后胎衣正常分離和排出是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及胎兒和母體內(nèi)多種生殖激素協(xié)同參與，任何激素水平的改變均有可能影響胎膜排出，導(dǎo)致胎膜滯留[2]。朱永剛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下患牛血清和胎盤組織中的孕酮、纖維蛋白溶酶原、前列腺素以及雌二醇含量的變化可能參與了胎衣不下的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。其次，奶?？寡趸芰Φ慕档鸵彩翘ヒ虏幌碌闹饕±硪蛩亍＝獓?guó)均等[4]的研究表明，血漿一氧化氮、丙二醛和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的變化可能是奶牛胎衣不下發(fā)生的原因之一?，F(xiàn)有的研究表明，奶牛機(jī)體抗氧化酶機(jī)能紊亂，隨之使雌激素生成減少，導(dǎo)致前列腺素F2α合成下降，子宮收縮力減弱，最終致使胎衣無(wú)法正常分離和順利排出[5,6]。

歸芎益母散是中藥制劑，治療奶牛胎衣不下臨床效果確切，有效率為85.9%～89.7%[7,8]。靶動(dòng)物安全性表明，歸芎益母散灌服、1次量400g/頭、每天1次、連用1～3d的用法與用量防治奶牛胎衣不下是安全的[9]。前期研究表明[8,10]，經(jīng)歸芎益母散治療后，受試奶牛血漿中 IL-2、TNF-ɑ、NO和6-keto-PGF1ɑ水平升高，而IL-4、IL-10、ET和TXB2水平降低，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子、ET/NO以及TXB2/6-keto-PGF1ɑ趨于平衡，說(shuō)明歸芎益母散不僅可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能，而且也可對(duì)抗內(nèi)皮功能紊亂和血小板功能紊亂，緩解患牛血瘀狀態(tài)。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)研究歸芎益母散對(duì)血瘀型胎衣不下患牛生殖激素和抗氧化能力的影響，探討其作用機(jī)制，旨在為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 藥物

歸芎益母散：400g/袋，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。

益母生化散：250g/袋，購(gòu)自華秦源（北京）動(dòng)物藥業(yè)有限公司（獸藥字（2012）010385148）。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物

荷斯坦牛，經(jīng)診斷確診為血瘀型胎衣不下奶牛。

1．3 主要試劑

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（LotNo:20170704），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase SOD）試劑盒（LotNo:20170706），丙二醛（Malondialdehyde，MAD）試劑盒（LotNo:20170705），均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；碘[125I]雌二醇放射免疫分析試劑盒（LotNo:20170520），碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒（LotNo: 20170520），PGF2αELISA 試劑盒LotNo:GR310884-3），均購(gòu)于abcam公司。

1．4 主要儀器

HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），SpectraMax? M2e酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司），SBC0060-230V離心機(jī)（Select BioProducts公司）。

2 方法

2．1 動(dòng)物的管理

舍飼飼養(yǎng)，配備臥床，按照高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)以及干奶期進(jìn)行分群，每個(gè)圈舍按20%頸夾富余率調(diào)整牛群數(shù)量，并根據(jù)營(yíng)養(yǎng)需要飼喂不同的全混合日糧，每日飼喂3次，自由采食、飲水。

2．2 動(dòng)物選擇

根據(jù)黃雪利[8,10]規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)、辨證標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)等入選標(biāo)準(zhǔn)，選擇受試奶牛。

2．3 分組與處理

將40頭血瘀型胎衣不下奶牛隨機(jī)分為4組，分別為歸芎益母散高、中、低劑量組和藥物對(duì)照組，每組10頭，另選擇10頭胎衣正常排出的健康奶牛為空白對(duì)照組（不給予藥物）。于給藥前，將藥物用20～25L開(kāi)水浸泡30min，候溫，灌服，每天1次，連續(xù)用藥1～3d。

2．4 樣品制備

于用藥后第0天和第7天，頸靜脈采血10mL，靜置，冷藏過(guò)夜，37℃水浴30min，3 500r/min，離心10min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．5 檢測(cè)指標(biāo)

采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）、二硫?qū)ο趸郊姿岱ê土虼捅韧姿岱?，檢測(cè)受試奶牛血清SOD、GSH-Px、MDA的含量；采用放射免疫法測(cè)定血清前列腺素（PGF2α）、孕酮和雌二醇的含量，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“mean±std”表示，P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3．1 歸芎益母散對(duì)血瘀型胎衣不下奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

給藥后第0天，與空白對(duì)照組比較，胎衣不下患牛血清GSH-Px、SOD含量低，MDA含量高，差異極顯著（P＜0.01）（表1）。給藥后第7天，與空白對(duì)照組比較，高、中劑量組中奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與藥物對(duì)照組比較，高、中劑量組奶牛血清GSH-Px含量高，差異極顯著（P＜0.01），低劑量組奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）（表2）。

表1 給藥后第0天各組奶牛血清氧化指標(biāo)

表2 給藥后第7天各組奶牛氧化指標(biāo)的變化

3．2 歸芎益母散對(duì)血瘀型胎衣不下奶牛生殖激素的影響

用藥前與空白對(duì)照組比較，胎衣不下患牛血清孕酮偏高，差異極顯著（P＜0.01），雌二醇水平低，差異顯著（P＜0.05），PGF2ɑ含量亦低，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。用藥后第7天，與空白對(duì)照組比較，歸芎益母散組奶牛血清中孕酮水平高，差異顯著（P＜0.05），PGF2ɑ含量差異不顯著（P＞0.05），高、中劑量組雌二醇差異不顯著（P＞0.05）；高、中劑量組孕酮極顯著低于藥物對(duì)照組（P＜0.01），高劑量組雌二醇顯著高于藥物對(duì)照組與低劑量組（P＜0.05）（表4）。

表3 用藥前各組血清激素含量變化

表4 用藥后第7天各組奶牛血清激素含量變化

4 討論

4．1 歸芎益母散對(duì)胎衣不下奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

正常情況下，機(jī)體的抗氧化能力與不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)引起組織損傷。若自由基產(chǎn)生異常增多或機(jī)體的抗氧化能力下降，將導(dǎo)致組織的氧化損傷[11]。SOD和GSH-Px是體內(nèi)清除自由基的主要酶類，這些酶類的活性反映了機(jī)體內(nèi)氧自由基被清除的能力，其氧化產(chǎn)物主要是MDA[12]。

鄧惠芳等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，奶水牛發(fā)生胎衣不下或子宮脫垂，其血漿和乳清中TAC水平降低，而MDA含量呈升高趨勢(shì)。Endler等[14]的研究表明，與胎盤正常自主排出產(chǎn)婦比較，胎衣不下患牛組織中GPX-1蛋白濃度水平降低，GPX1 mRNA表達(dá)量也出現(xiàn)下降趨勢(shì)。GPX是一種硒依賴性抗氧化酶，在細(xì)胞抗氧化防御中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，奶牛機(jī)體對(duì)活性氧抗氧化能力的下調(diào)，增加了奶?；继ヒ虏幌碌娘L(fēng)險(xiǎn)[15]。由此可見(jiàn)，機(jī)體對(duì)氧化酶抗氧化防御作用的抑制間接或直接影響胎衣不下的發(fā)生。

本研究中，胎衣不下奶牛血清GSH-Px和SOD活性較低，而MDA處于較高狀態(tài)。經(jīng)歸芎益母散治療后，患牛血清中GSH-Px活性上調(diào)，MDA含量下降，說(shuō)明歸芎益母散可通過(guò)上調(diào)患?？寡趸富钚裕岣邫C(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。其作用機(jī)理可能是，復(fù)方中益母草和川芎可提高GSH-Px活性[16,17]，當(dāng)歸中多糖和阿魏酸能夠降低MDA水平[18]。

4．2 歸芎益母散對(duì)胎衣不下奶牛生殖激素的影響

奶牛產(chǎn)犢前后，機(jī)體內(nèi)多種生殖激素協(xié)同參與胎衣分離和排出。其中，孕酮是一種維持妊娠的重要激素，可抑制子宮肌的自發(fā)性活動(dòng)，保持子宮安靜[19]。而分娩時(shí)，血漿孕酮水平降低，則可促進(jìn)子宮收縮；同時(shí)，雌激素水平升高，可促進(jìn)PGF2α合成，子宮收縮增強(qiáng)。因此，妊娠后期，機(jī)體孕酮和雌激素的協(xié)同作用，有利于胎兒娩出和胎衣排出[5,6]。

朱永剛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下患牛血清和胎盤組織中孕酮、PGF2α水平明顯降低，而雌二醇水平則升高。Mcnaughton等[15]研究表明，胎衣不下患牛胎盤組織中雌二醇和PGF2α較低，而類固醇激素受體表達(dá)增加，導(dǎo)致子宮絨毛膜上皮細(xì)胞凋亡率降低，增加了奶牛胎衣不下發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。王曉芳等[20]探討了中藥“本草-產(chǎn)安”預(yù)防胎衣不下的效果及機(jī)制，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組奶牛胎盤組織中孕酮水平顯著低于對(duì)照組，胎衣不下發(fā)病率極顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，產(chǎn)前奶牛機(jī)體激素分泌紊亂可能參與了胎衣不下的發(fā)生過(guò)程。本研究中，胎衣不下患牛血清孕酮水平顯著較高，而雌二醇、PGF2α水平則明顯較低。

前期研究結(jié)果表明，益母草具有改善子宮、卵巢血液循環(huán)，調(diào)節(jié)性激素分泌和代謝的作用[21,22]；當(dāng)歸能顯著提高大鼠血清雌二醇的濃度[23]；當(dāng)歸-川芎可降低PGF2α濃度[24]；三棱-莪術(shù)組分配伍可降低子宮肌瘤病實(shí)驗(yàn)大鼠雌二醇、孕酮含量[25]，說(shuō)明歸芎益母散中單味藥或合劑具有調(diào)節(jié)機(jī)體生殖激素的藥理作用。本研究表明，經(jīng)歸芎益母散治療后，胎衣不下奶牛血清孕酮水平明顯降低，而雌二醇含量升高，說(shuō)明歸芎益母散可調(diào)節(jié)胎衣不下患牛血清激素失衡，進(jìn)而達(dá)到病愈的治療效果。

5 結(jié)論

本研究得出，歸芎益母散可通過(guò)提高患牛機(jī)體抗氧化能力以及調(diào)節(jié)患牛血清中生殖激素而達(dá)到治愈胎衣不下的治療效果。