潘波 陳喜生

(1.國藥控股股份有限公司，上海 200030；2.國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，福建 廈門 361026)

0 引言

葉酸是指必需的水溶性B族維生素類藥物，由三個部分組成：蝶啶環(huán)，對氨基苯甲酸酯和谷氨酸。多官能團的結(jié)構(gòu)賦予了葉酸復雜化學性質(zhì)，使得葉酸較易含有結(jié)晶水和吸附水[1]，穩(wěn)定性受到pH，溫度，光線，氧化劑和還原劑的影響。在受熱的情況下，葉酸通常通過在C9-N10處裂解而降解，生成6-甲?；屎桶被郊姿醄3]，因此，干燥失重測水分的方法不適用于葉酸。目前《中華人民共和國藥典》以下簡稱《中國藥典》)2015年版采用卡爾費休法進行水分測定[3]，葉酸的水分在測定時釋放緩慢，使得水分檢測時間較長[4]，增大了環(huán)境因素對檢測結(jié)果的影響。通過將葉酸樣品中的水分轉(zhuǎn)移到易釋放水分的溶劑中，設(shè)置轉(zhuǎn)移所需要的萃取時間，避免滴定過程提前結(jié)束，使葉酸水分釋放更充分。因此，本文采用三氯甲烷-無水甲醇萃取水分的溶劑，使用萬通915卡式費休水分測定儀測定葉酸水分，通過研究萃取時間與水分檢測結(jié)果的關(guān)系，確定最佳萃取時間，以提高卡爾費休法測定葉酸水分的準確性。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀器與試劑

卡氏水分儀(915，萬通)，電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；卡爾費休試劑(3.6mg/mL)，甲醇(分析級)，三氯甲烷(分析純)均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 樣品來源

葉酸對照品來自中國食品藥品檢定研究所；葉酸樣品來自河北冀衡(集團)藥業(yè)有限公司。

2 試驗方法

2.1 反應(yīng)時間對葉酸水分檢測的影響

按照藥典準確稱取純化水10mg，用水分測定儀進行標定。另作空白試驗，計算[3]。按照藥典準確稱取供試品0.1g，溶劑為無水甲醇，用水分測定儀直接測定，獲得水分含量[3]。

2.2 設(shè)備相關(guān)參數(shù)

萬通915卡氏水分儀方法設(shè)置參數(shù)為：“滴定速度”設(shè)置為最優(yōu)；“停止判據(jù)”設(shè)置為“漂移”；“停止漂移”為20μL/min；“漂移校正”設(shè)置為自動；進行水分測定的“萃取時間”分別設(shè)置為0～400s。

3 結(jié)果與分析

3.1 供試品水分測定結(jié)果與分析

在不同萃取時間下，滴定過程中消耗的卡爾費休試劑量與滴定時間的關(guān)系如圖1所示，萃取時間的延長，維持高速滴定反應(yīng)的時間延長，水分釋放更加充分。隨后反復出現(xiàn)滴定啟動與中止交替現(xiàn)象，每次滴定的體積減少，中斷的時間增加。隨著滴定反應(yīng)的進行，反應(yīng)體系的水分越來越少，水分釋放速度越來越慢，當?shù)味ǚ磻?yīng)消耗水的速度大于體系所能夠提供水，閾值范圍內(nèi)不能滿足啟動滴定反應(yīng)的要求則檢測過程結(jié)束。

圖1 不同萃取時間卡爾費休試劑的消耗情況

萃取時間設(shè)為400s，在滴定反應(yīng)的0～21s內(nèi)，萃取劑中的水分高速釋放，反應(yīng)體系水分充足，滴定速度恒定，出現(xiàn)卡爾費休試劑高速消耗的現(xiàn)象。在滴定反應(yīng)的21～400s內(nèi)，滴定過程頻繁出現(xiàn)中止又繼續(xù)進行滴定的現(xiàn)象，啟動滴定系統(tǒng)進行滴定反應(yīng)的時間越來越長，說明從葉酸樣品向滴定體系釋滿足最小滴定體積的卡爾費休試劑完成反應(yīng)所需要水的時間越長，再次啟動滴定消耗的卡爾費休試劑的體積越少，說明從葉酸樣品向滴定體系釋補充水的量越少。

證明葉酸樣品在水分釋放過程中，葉酸樣品本身的水分含量越來越低，釋放水分的速度越來越慢。由圖2a水分含量與反應(yīng)時間變化關(guān)系可以看到，在滴定過程的0～200s，隨著反應(yīng)時間的延長，測出的水分含量越來越高，增長的幅度越來越小，在滴定過程的200～400s，隨著反應(yīng)時間的延長，測出的水分含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，如圖2b相關(guān)性系數(shù)R=0.9994，相關(guān)系良好，說明水分增速恒定。但與上述葉酸樣品在水分釋放過程中速度越來越慢的現(xiàn)象矛盾，證明葉酸樣品在250s后水分釋放不是導致檢測水分上升的主要原因，葉酸樣品釋放水分遠小于其他方面的水分來源，滴定體系中的水分來源于滴定體系周圍相對恒定的環(huán)境。

水分含量與萃取時間的變化關(guān)系如圖2c所示，萃取時間在0～400s內(nèi)，隨著時間延長，樣品中檢測出來的含水量越高，延長萃取時間使得葉酸中的水分釋放更加充分，含水量的檢測結(jié)果更加準確。萃取時間超過200～400s后，水分含量與萃取時間呈正比關(guān)系，如圖2d所示，并且相關(guān)系數(shù)R=0.9993，線性關(guān)系良好，水分含量的增量恒定，與樣品水分釋放逐漸減慢不相符，說明啟動設(shè)備進行滴定反應(yīng)的這部分水來源不是由樣品中的水分釋放導致，可能是由于周圍環(huán)境中的水分進入以恒定的速度進入萃取體系導致，即葉酸樣品在萃取階段的第200s至400s釋放的水分趨近于0，延長萃取時間不會使得樣品中的水分萃取率提高，因此可以將200s作為最佳萃取時間。

延長萃取時間有利于葉酸樣品充分釋放水分，但增大了環(huán)境因素提高葉酸檢測結(jié)果的風險，從避免延長萃取時間環(huán)境中的水分檢測影響，使樣品中的水分充分釋放的角度考慮，顯然萃取200s是萃取的最佳時間。

圖2 滴定過程的水分變化情況

3.2 葉酸對照品的水分測定的結(jié)果與分析

在對照品的檢測過程中，檢測到葉酸中含有7.78%的水，另外，李娜等[2]關(guān)于葉酸標準品的研究報道顯示葉酸標準品含有7%～9%的水分，均印證葉酸易吸收水分與攜帶結(jié)晶水的特性，通常以含水的混合物形式存在。在《中國藥典》2015版中對于葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6[4]，描述了葉酸的活性部分，不能體現(xiàn)葉酸供試品、對照品與標準品通常以含水的混合物的形式存在，而對葉酸活性部分的物質(zhì)含量檢測具有重要影響。建議將葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6,xH2O，能夠直觀體現(xiàn)葉酸主要以含水的混合物形式存在。

4 結(jié)語

水分測定的結(jié)果將會影響原料的含量測定以及對照品賦值結(jié)果的準確，本文采用萬通915卡爾費休水分測定儀測不同萃取時間下葉酸水分的含量，確定在滴定前將葉酸樣品的水分萃取時間設(shè)為200s，能夠更加精確測得葉酸樣品中的水分含量，為葉酸水分的質(zhì)量標準制定提供參考方法。

在葉酸的樣品與對照品的研究過程中，以及已報道的關(guān)于葉酸標準品的研究過程中，均檢測到7%～9%的水分。建議將葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6,xH2O，有助于研究人員、檢測人員、公眾等對葉酸的認識更加直觀。