譚睿陟 余 艷 王 麗 何 濤

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000)

越來越多的證據(jù)表明，先天性和獲得性免疫所涉及的巨噬細(xì)胞在多種疾病的病理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，如牙周炎、急性肺損傷、非酒精性脂肪肝、急慢性腎病等[1-4]。在疾病發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞浸潤到損傷部位，在某些因子的刺激下分泌出炎癥因子，促進(jìn)了炎癥的發(fā)生發(fā)展，加重了器官損傷[5]。有證據(jù)顯示，通過系統(tǒng)性地去除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可緩解急性腎損傷，表明巨噬細(xì)胞在急性腎損傷中的功能性作用[6,7]。然而在急性腎損傷中完全清除巨噬細(xì)胞會導(dǎo)致腎臟修復(fù)能力降低，提示完全去除巨噬細(xì)胞并不能作為改善疾病炎癥的有效方法[8]。由于巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，在不同的刺激條件下會發(fā)生極化。已有研究證明，TLR4-NF-κB信號是激活M1型巨噬細(xì)胞(促炎細(xì)胞)并產(chǎn)生iNOS、 TNF-α、 IL-1β、IL-6和MCP-1的重要途徑[5,9]。與之相反，M2型巨噬細(xì)胞(抗炎細(xì)胞)則在疾病中起修復(fù)作用，其主要是通過IL-4/IL-13(M2a型)或IL-10、TGF-β1和GM-CSF-1(M2b/c型)誘導(dǎo)而來[9，10]。因此，減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞，增加M2巨噬細(xì)胞可能是抑制炎癥的有效途徑。近期有研究表明，巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)型C型凝集素(macroph-age-inducible C-type lectin，Mincle)是激活和維持急性腎損傷炎癥中M1巨噬細(xì)胞表型和功能的關(guān)鍵要素[11]。Mincle為跨膜種系編碼的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可與損傷相關(guān)分子模式蛋白(damage-associated molecular patterns，DAMP)和病原體相關(guān)分子模式蛋白(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)結(jié)合起免疫效應(yīng)[12，13]。因此在巨噬細(xì)胞中敲除Mincle可為巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的炎癥研究提供重要素材。CRISPR/Cas9技術(shù)是目前最前沿的基因修飾技術(shù)，可用于細(xì)胞和動物的基因編輯[14]。CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒(融合Cas9和gRNA的質(zhì)粒)可通過顯微注射法注射到小鼠胚胎中建立基因修飾小鼠[15]；也可轉(zhuǎn)染到組織器官固有細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞中建立基因修飾細(xì)胞系[16]。然而，轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體到免疫細(xì)胞建立基因修飾的免疫細(xì)胞卻非常困難，特別是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，這可能是由于免疫細(xì)胞對外源物質(zhì)的抵抗作用。因此，目前多用病毒感染或電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體，但病毒包裝較為復(fù)雜，且花費(fèi)較多[17]。本研究將利用具有四步電轉(zhuǎn)程序的電轉(zhuǎn)儀，通過電轉(zhuǎn)染，基于CRISPR/Cas9技術(shù)將Mincle敲除載體轉(zhuǎn)染至RAW264.7巨噬細(xì)胞，摸索出最佳的巨噬細(xì)胞電轉(zhuǎn)條件，并在敲除Mincle的巨噬細(xì)胞中驗(yàn)證LPS刺激下巨噬細(xì)胞極性和炎癥的改變。

1 材料與方法

1.1材料 鼠源巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購于上海細(xì)胞庫；px-458骨架質(zhì)粒購于ADDGENE公司；sgRNA及Real-Time PCR引物由上海生工生物有限公司合成；高效基因電轉(zhuǎn)系統(tǒng)NEPA21購于廣州華粵行儀器有限公司；質(zhì)粒大抽試劑盒(MACHEREY-NAGEL)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒(TIANGEN)；T4 DNA連接酶、T4 PNK、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；Real-Time PCR試劑盒(QIAGEN)；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ(TaKaRa)；DMEM高糖培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；Mincle抗體、β-actin抗體(Santa Cruz)；Alexa 488抗鼠熒光二抗(CST)；HRP偶聯(lián)兔抗鼠IgG(Abway)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物(四正柏生物)；MTT(Affymetrix)； IL-1β，IL-6和IL-10 ELISA試劑盒(欣博盛)。

1.2方法

1.2.1Mincle敲除靶點(diǎn)的篩選和寡核苷酸鏈的合成 根據(jù)CRISPR/Cas9的作用原理，在CRISPR在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站中輸入鼠源Mincle的cDNA序列(https://zlab.bio/guide-design-resources)，選擇評分較高且位于2號外顯子的靶點(diǎn)作為目標(biāo)靶點(diǎn)。該靶點(diǎn)位于反義鏈，在反義鏈5′端添加CACC，正義鏈5′端添加AAAC，添加后的靶點(diǎn)序列為：F：5′-CACCGGAGGCCCCGGCTATCGTCC-3′,R：5′-AAACGGACG-ATAGCCGGGGCCTCC-3′；鑒定引物為：F：5′-GTTAGCTTTCTGGGTGAGGA-3′，R：5′-AAACAACAAA-GTCGGTCAAG-3′。

1.2.2px-458-Mincle質(zhì)粒的構(gòu)建 sgRNA磷酸化與變性：合成的正反向Mincle-sgRNA各1 μl(100 μmol/L)加入0.5 μl T4 PNK、6.5 μl ddH2O、1 μl 10×T4 Ligation buffer，37℃ 30 min、95℃ 5 min反應(yīng)后梯度降溫至25℃，1∶200稀釋備用；載體連接：50 ng用BbsⅠ酶切后回收的線性化px-458載體加入1 μl稀釋后的sgRNA變性產(chǎn)物、2 μl 10×T4 Ligation buffer、0.5 μl T4 DNA連接酶，加ddH2O至20 μl，22℃ 10 min；轉(zhuǎn)化：取100 μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，加入上步的連接產(chǎn)物5 μl，混勻后置于冰上30 min，將感受態(tài)細(xì)胞放入42℃水浴中熱激90 s后立即冰浴2 min，加入0.9 ml未加抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃溫育1 h，4 000 r/min離心3 min，留200 μl上清將菌體打散，均勻涂布與含Amp抗生素的瓊脂糖平板上，倒扣于37℃培養(yǎng)箱過夜；克隆挑選：隨機(jī)挑取在培養(yǎng)皿中長出的單克隆5個(gè)，分別將其加入含有Amp抗性的4 ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床上120 r/min溫育過夜，分別凍存部分菌液后，用質(zhì)粒小抽試劑盒提取剩余菌液的質(zhì)粒DNA，分別將5個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA送往公司測序。測序引物：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′，測序結(jié)果顯示sgRNA準(zhǔn)確插入質(zhì)粒，即表明px-458-Mincle載體構(gòu)建成功。

1.2.3RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%胎牛血清和合適濃度的青霉素、鏈霉素，37℃ 5%CO2孵育培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)即可傳代。電轉(zhuǎn)前，將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞密度長為80%時(shí)即可開始電轉(zhuǎn)。

1.2.4px-458-Mincle質(zhì)粒的電轉(zhuǎn) 將大抽提取得到的px-458-Mincle質(zhì)粒用OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋到1 μg/μl，總體積不低于300 μl。準(zhǔn)備一個(gè)干凈的24孔板，1孔為70%乙醇，2孔為OPTI-MEM培養(yǎng)基，將電極(CUY900-13-3-5，24孔板貼壁轉(zhuǎn)染專用)提前放入超凈臺紫外照射10 min，然后將電極浸泡于70%乙醇中消毒3～5 s，轉(zhuǎn)入空孔中晾干電極后再將其移入OPTI-MEM中清洗兩次。從孵箱中取出細(xì)胞，用OPTI-MEM清洗1～2次，吸出OPTI-MEM培養(yǎng)基，加入300 μl質(zhì)粒稀釋液，將電極置于孔中，用手扶穩(wěn)電極，測量電阻于170～300 Ω之間后即可開始按照設(shè)定程序執(zhí)行電轉(zhuǎn)(表1)，第1次電轉(zhuǎn)后將電極旋轉(zhuǎn)90°再執(zhí)行1次電轉(zhuǎn)，回收質(zhì)粒稀釋液(可凍存后多次使用)，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h觀察熒光(px-458載體自帶EGFP熒光)并消化提取細(xì)胞用于后續(xù)鑒定。

表1 電轉(zhuǎn)參數(shù)Tab.1 Set parameters

1.2.5電轉(zhuǎn)后細(xì)胞存活檢測 采用MTT法檢測電轉(zhuǎn)后細(xì)胞存活情況。接種2×105個(gè)細(xì)胞于24孔板，培養(yǎng)24 h使其貼壁。按照各電轉(zhuǎn)參數(shù)電轉(zhuǎn)后用PBS清洗細(xì)胞2次，洗去死細(xì)胞，加入200 μl 0.5%MTT溶液培養(yǎng)4 h。棄去MTT溶液后，PBS洗2次，加入400 μl DMSO，室溫避光振蕩10 min。吸取100 μl紫色溶液至96孔板，并放入酶標(biāo)儀中采用570 nm波長(參考波長630 nm)測量OD值。

1.2.6Mincle敲除細(xì)胞株單克隆的篩選和測序鑒定 將電轉(zhuǎn)后48 h的細(xì)胞通過流式分選儀篩選出具有熒光的細(xì)胞，以0.5個(gè)/孔接種于多個(gè)96孔板，也可在超凈臺中借助顯微鏡用接有濾頭的口徑為100 μm的玻璃口吸管吸取單個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。待單個(gè)細(xì)胞長出克隆以后分盤擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存部分細(xì)胞后提取細(xì)胞的DNA，并采用鑒定引物擴(kuò)增PCR，產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果和Mincle原始序列比較。靶點(diǎn)附近缺失純合子，且缺失堿基為非3的倍數(shù)即為敲除成功，進(jìn)入蛋白表達(dá)鑒定環(huán)節(jié)。

1.2.7Mincle敲除細(xì)胞Mincle蛋白表達(dá)的檢測

1.2.7.1細(xì)胞免疫熒光 野生型RAW264.7細(xì)胞和Mincle敲除RAW264.7細(xì)胞分別接種于細(xì)胞爬片，24 h后去除培養(yǎng)基，加入PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗兩次后用5%山羊血清室溫封閉30 min，隨后加入1%山羊血清PBS溶液1∶100 稀釋的Mincle一抗，4℃過夜孵育。去除一抗后，PBS洗兩次，加入1%山羊血清PBS溶液1∶200稀釋的熒光二抗，避光室溫孵育1 h，隨后PBS清洗兩次加入DAPI染核后封片，熒光顯微鏡檢測。

1.2.7.2Western blot 野生型RAW264.7細(xì)胞和Mincle敲除RAW264.7細(xì)胞分別接種于6孔板，待細(xì)胞密度90%后，除去培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，加入150 μl RIPA裂解液刮下細(xì)胞，冰上放置30 min，超聲后離心去除沉淀，上清測定蛋白濃度。向10%的聚丙烯酰胺凝膠中加入30 μg的各組蛋白樣品，100 V 電泳1.5 h。將凝膠置于PVDF膜，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，80 V轉(zhuǎn)膜45 min。5%山羊血清室溫封閉1 h，1%山羊血清PBS溶液1∶1 000稀釋的Mincle一抗，4℃過夜孵育。去除一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，加入1∶3 000稀釋HRP偶聯(lián)兔抗鼠IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光并上機(jī)檢測。

1.2.8Mincle敲除細(xì)胞LPS刺激后炎癥因子和細(xì)胞極性標(biāo)志物表達(dá)檢測 將通過測序分析、免疫熒光和Western blot檢測確認(rèn)的Mincle敲除細(xì)胞和正常RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)過夜后加入100 ng/ml的LPS刺激12 h，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用Real-Time PCR試劑盒完成PCR檢測，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。對應(yīng)的引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2.9細(xì)胞上清中炎癥因子分泌的檢測 采用ELSIA試劑盒檢測各組細(xì)胞上清液中促炎因子IL-1β和IL-6，抗炎因子IL-10的濃度。細(xì)胞在加入LPS 24 h后收集上清，3 000 r/min離心10 min去除沉淀，將100 μl上清液加入ELISA板反應(yīng)孔，37℃孵育90 min，洗板3次，每孔加入生物素化抗體稀釋液100 μl，37℃反應(yīng)60 min，洗板3次，加入酶結(jié)合物工作液，37℃避光孵育30 min，洗板并加入顯色底物和終止液，酶標(biāo)儀于450 nm波長讀取數(shù)值，并最終得到對應(yīng)炎癥因子濃度。

2 結(jié)果

2.1px-458-Mincle質(zhì)粒電轉(zhuǎn)RAW264.7細(xì)胞的最佳條件 電轉(zhuǎn)結(jié)果顯示，當(dāng)電轉(zhuǎn)時(shí)間為2.5 ms時(shí)，電轉(zhuǎn)效率很低，而當(dāng)電轉(zhuǎn)時(shí)間調(diào)整為5 ms，且電壓為250 V和300 V時(shí)，電轉(zhuǎn)效率顯著提升，最高電轉(zhuǎn)率達(dá)到了30.7%(圖1)。MTT結(jié)果表明，當(dāng)電轉(zhuǎn)時(shí)間調(diào)整為7.5 ms時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，(250 V，7.5 ms)和(300 V，7.5 ms)組細(xì)胞死亡率與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，故最佳電轉(zhuǎn)條件為300 V，5 ms。

圖1 電轉(zhuǎn)效率檢測Fig.1 Electroporation efficiency detection

2.2電轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9質(zhì)粒有較高的基因敲除成功率 流式細(xì)胞分選技術(shù)獲得的單個(gè)熒光陽性細(xì)胞分別建立了36個(gè)細(xì)胞克隆，測序結(jié)果顯示，突變率為58.33%，純合子突變率為22.22%，敲除成功率為16.67%(缺失堿基數(shù)非3的倍數(shù))(表3)，其中敲除成功的細(xì)胞編號分別為1B5、1C5、1C6、2A3、2B3、2D3，其測序結(jié)果比對見圖2。

圖2 敲除成功的細(xì)胞株序列比對Fig.2 Sequence alignment of Mincle knockout cell line

表3 Mincle敲除結(jié)果Tab.3 Results of Mincle knockout

其中，1B5、1C5、2B3、2D3分別在靶點(diǎn)的PAM區(qū)前面3～4個(gè)堿基處缺失1個(gè)堿基，1C6在PAM區(qū)前面3～4個(gè)堿基處缺失4個(gè)堿基，2A3在靶點(diǎn)附近缺失87個(gè)堿基，但只有85個(gè)缺失的堿基位于外顯子，因此6個(gè)細(xì)胞株在靶點(diǎn)附近缺失的堿基數(shù)均非3的倍數(shù)。

2.3Mincle敲除細(xì)胞的Mincle蛋白表達(dá)檢測 本研究選用1C6號細(xì)胞株采用免疫熒光和Western blot檢測Mincle蛋白在敲除細(xì)胞中變化。免疫熒光結(jié)果顯示，1C6號細(xì)胞的Mincle蛋白完全缺失。野生型RAW264.7巨噬細(xì)胞中Mincle表達(dá)于細(xì)胞膜，Mincle敲除后，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均未見Mincle蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果表明，1C6號細(xì)胞中Mincle蛋白條帶消失(P<0.001)，證明Mincle在該細(xì)胞系中敲除成功。見圖3。

圖3 Mincle敲除RAW264.7細(xì)胞中Mincle蛋白缺失Fig.3 Mincle protein is lost in Mincle KO RAW264.7 cellNote:Compared with control,***.P<0.001.

2.4Mincle敲除可顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥 未敲除Mincle時(shí)，LPS刺激可顯著提升IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1表達(dá)，敲除Mincle后，LPS刺激下細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1表達(dá)顯著降低(P<0.001)，見圖4A～D。而Mincle敲除后，抑制炎癥的因子IL-10在LPS刺激下表達(dá)增加(P<0.01)，見圖4E。ELISA進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示，Mincle敲除顯著降低了LPS刺激下促炎因子IL-1β和IL-6分泌(P<0.001，圖4F、G)，增加了抑制炎癥因子IL-10分泌(P<0.001，圖4H)，提示Mincle可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)和分泌，可能參與了巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的疾病或炎癥。

圖4 Mincle敲除顯著降低了LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)Fig.4 Mincle knockout significantly reduces expression of inflammatory factor induced by LPSNote:**.P<0.01，***.P<0.001.

2.5Mincle敲除可平衡LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極性 LPS刺激下，巨噬細(xì)胞極性平衡被打破，M1巨噬細(xì)胞增加，M2巨噬細(xì)胞減少。Mincle敲除后，LPS刺激下的巨噬細(xì)胞極性平衡得到有效恢復(fù)。iNOS(M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)表達(dá)顯著降低(P<0.001)，CD206(M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)表達(dá)顯著升高(P<0.001)，提示Mincle在維護(hù)M1巨噬細(xì)胞極性中具有重要作用。見圖5。

圖5 Mincle敲除對M1、M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig.5 Effect of expressions on Mincle knockout of M1，M2 macrophage markerNote:***.P<0.001.

3 討論

本研究采用NEPA21高效電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)進(jìn)行巨噬細(xì)胞系RAW264.7敲除Mincle的條件摸索，成功構(gòu)建了Mincle敲除RAW264.7巨噬細(xì)胞系，并驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞缺失Mincle后可顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)并平衡巨噬細(xì)胞極性。NEPA21電轉(zhuǎn)儀采用了四步法電轉(zhuǎn)程序，包括電穿孔模式、反向電穿孔模式、基因?qū)肽Ｊ胶头聪驅(qū)肽Ｊ剑瘸Ｒ?guī)的電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染效率高，且提高了細(xì)胞存活率，目前，該電轉(zhuǎn)儀不僅用于貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，還可用于懸浮細(xì)胞、哺乳動物胚胎和活體器官電轉(zhuǎn)，已廣泛用于各種基因修飾研究[18]。課題組的前期研究中采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式嘗試建立Mincle敲除的RAW264.7細(xì)胞株，選用了多種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如Lipofecta-min2000、Lipofectamin3000和LipoD293，即便是采用說明書推薦的最高濃度轉(zhuǎn)染也均不能獲得較多的熒光陽性RAW264.7細(xì)胞，說明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對免疫細(xì)胞的低效性，其可能是由于免疫細(xì)胞對外源物質(zhì)的抵抗作用導(dǎo)致的。而慢病毒轉(zhuǎn)染需要病毒包裝，花費(fèi)大量時(shí)間和試劑。因此，本研究運(yùn)用新一代的電轉(zhuǎn)儀NEPA21電轉(zhuǎn)px-458-Minlce質(zhì)粒建立Mincle敲除的RAW264.7巨噬細(xì)胞。參照NEPA21電轉(zhuǎn)儀的說明書設(shè)置參數(shù)，除了電打孔階段的電壓和電轉(zhuǎn)時(shí)間為可修改參數(shù)外，其余參數(shù)均不變。為了摸索該電轉(zhuǎn)儀對RAW264.7細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)，設(shè)置了多個(gè)電壓和電轉(zhuǎn)時(shí)間，分別是：(125 V，2.5 ms)、(150 V，2.5 ms)、(200 V，2.5 ms)、(250 V，2.5 ms)、(300 V，2.5 ms)、(200 V，5 ms)、(250 V，5 ms)、(300 V，5 ms)、(250 V，7.5 ms)和(300 V，7.5 ms)。最終通過一系列實(shí)驗(yàn)摸索，確定電穿孔電壓300 V，電穿孔時(shí)間5 ms的參數(shù)具有最佳的巨噬細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。值得注意的是，該儀器常規(guī)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)僅需要 200 V、2.5 ms，進(jìn)一步說明巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染的難度大。通過流式細(xì)胞分選獲取的電轉(zhuǎn)后熒光陽性細(xì)胞的Mincle靶點(diǎn)突變率達(dá)到58.33%，純合子突變率高達(dá)22.22%，說明CRISPR/Cas9質(zhì)?？捎糜谠撾娹D(zhuǎn)法，且突變效率高，適用于難度大的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

Mincle是表達(dá)于巨噬細(xì)胞上的C型凝集素受體，與多種不同的配體結(jié)合能夠發(fā)揮促炎效果。目前已有研究報(bào)道顯示，Mincle參與宿主防御，在炎癥、免疫性疾病，感染性疾病(包括病毒、真菌、結(jié)核桿菌感染性疾病)和腫瘤中具有重要作用[19]。Mincle可促進(jìn)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫抑制，從而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展，提示Mincle通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境參與腫瘤免疫反應(yīng)[20]。Mincle還參與自身免疫性眼炎、肝炎、腦炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，Mincle可與膽固醇結(jié)晶結(jié)合活化巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，提示其可能參與了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展[21，22]。同時(shí)，Mincle 還與肥胖誘導(dǎo)組織纖維化相關(guān)，提示Mincle可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞參與組織重構(gòu)和纖維化[23]。雖然對Mincle的研究日益增多，但目前Mincle參與和誘導(dǎo)這些炎癥、免疫疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制尚不明確。近期有研究報(bào)道，Mincle在急性腎損傷中維護(hù)了M1巨噬細(xì)胞極性，促進(jìn)了炎癥的發(fā)生發(fā)展，在急性腎損傷中沉默Mincle可有效降低M1巨噬細(xì)胞數(shù)量，減少炎癥，保護(hù)腎臟，提示Mincle參與炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能與其對M1巨噬細(xì)胞的維護(hù)有關(guān)[11]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過電轉(zhuǎn)CRISPR/Cas9質(zhì)粒的方式在RAW264.7巨噬細(xì)胞系中建立Mincle敲除細(xì)胞株。通過對Mincle敲除株的研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7巨噬細(xì)胞中敲除Mincle可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)和分泌M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)，并增加M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)，說明Mincle可能通過維護(hù)M1巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞中的Mincle可能是多種炎癥疾病的治療途徑和靶點(diǎn)。然而目前的研究均未找到Mincle維護(hù)巨噬細(xì)胞極性的具體機(jī)制，對其的研究也主要體現(xiàn)在作用的驗(yàn)證上。本課題組認(rèn)為可以從調(diào)控巨噬細(xì)胞極性的轉(zhuǎn)錄因子入手，分析Mincle是否直接或間接地與這類轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進(jìn)而維護(hù)巨噬細(xì)胞極性。課題組的后續(xù)研究將運(yùn)用此細(xì)胞株開展Mincle調(diào)控巨噬細(xì)胞極性的機(jī)制研究以及與炎癥相關(guān)的機(jī)制探索。

本研究結(jié)果表明采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9敲除質(zhì)?？捎行У卦赗AW264.7巨噬細(xì)胞中建立基因敲除細(xì)胞株，其突變效率高，對細(xì)胞的損傷小。在RAW264.7巨噬細(xì)胞中敲除Mincle顯著降低了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，其可能與抑制了巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，恢復(fù)其M2型表型有關(guān)，說明了Mincle在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的重要作用。