郭水根 舒慧珍

(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201399)

肺腺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率有升高趨勢，研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制對其診斷和治療具有重要價值[1]。肺腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多階段、多因素共同作用的結(jié)果。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長度大于200 nt的RNA，不編碼蛋白質(zhì)，可在不同水平對染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DGCR5在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低[3，4]；在肺腺癌中，DGCR5表達(dá)升高，對肺腺癌的診斷和預(yù)后評價具有重要價值，但其對肺腺癌增殖、侵襲及遷移的作用機(jī)制尚不明確[5]。惡性腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在細(xì)胞侵襲和遷移中具有重要作用，可增加惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力[6]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 信號通路在EMT中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。因此本文通過沉默DGCR5觀察其對肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討DGCR5在肺腺癌中的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人肺腺癌H1650和A549細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 siRNA-DGCR5和陰性對照siRN A購自上海吉瑪公司；qRT-PCR試劑盒、Lipofec-tamineTM轉(zhuǎn)染試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑、CCK8試劑盒等購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人Vimentin多克隆抗體、兔抗人β-catenin多克隆抗體、兔抗人p-gsk-3β多克隆抗體購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將生長良好的H1650和A549細(xì)胞株接種于6孔板(5×105個/孔)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為空白對照組(Blank)、陰性對照組(NC)和siRNA-DGCR5組(si-DGCR5)，待細(xì)胞生長至70%以上融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各組細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)基，使用脂質(zhì)體2000、按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，si-DGCR5組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-DGCR5，NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-NC，Blank組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液，選擇轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞備用。

1.2.2qRT-PCR測量各組H1650和A549細(xì)胞中DGCR5水平 取轉(zhuǎn)染24 h的各組H1650和A549細(xì)胞，TRIzol提取總RNA，取RNA樣品1 μl，測定純度和濃度。將得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR測量各組H1650和A549細(xì)胞中DGCR5水平，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，共42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。H1650和A549細(xì)胞中DGCR5水平以2-ΔΔCt計算。

1.2.3CCK8測定各組H1650和A549細(xì)胞增殖 收集貼壁生長的H1650和A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml，加入96孔板培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照1.2.1，每組設(shè)7個復(fù)孔，分別在24、48、72 h向各孔中加入CCK8溶液10 μl，孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定各組波長450 nm處OD值。

1.2.4Transwell測定各組H1650和A549細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel基質(zhì)膠融化成液態(tài)，在Trans-well小室上室加入基質(zhì)膠孵育30 min，將轉(zhuǎn)染后 24 h 的H1650和A549細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個/ml，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入培養(yǎng)液，每組設(shè)7個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦去未穿透細(xì)胞，加入多聚甲醛固定20 min，加入結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照觀察每個高倍視野侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5劃痕實驗測定各組H1650和A549細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染24 h各組H1650和A549細(xì)胞接種于6孔板，3×105個/孔，待細(xì)胞貼壁生長后更換培養(yǎng)基，用10 μl槍頭垂直劃4條平行線，每組設(shè)7個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，分別在0 h和24 h拍照，觀察各組細(xì)胞遷移情況，測量各組細(xì)胞遷移距離。

1.2.6Western blot測定各組H1650和A549細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染24 h的H1650和A549細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后,以12 000 r/min離心15 min，取上清液以相同條件再次離心15 min，BCA法測定上清液中蛋白濃度。制備電泳凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：兔抗人E-cadherin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人Vimentin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人β-catenin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人p-gsk-3β多克隆抗體(1∶300)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參，加入二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，于暗室曝光、顯影液中顯影、定影液中定影，采用Quantity One軟件分析條帶亮度，H1650和A549細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平以其蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞中DGCR5水平的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組DGCR5水平降低(P<0.05)；Blank組和NC組DGCR5水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組H1650和A549細(xì)胞中DGCR5水平比較Tab.1 Comparison of DGCR5 levels in H1650 and A549 cells of each

2.2沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞增殖的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組OD值降低(P<0.05)；Blank組和NC組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3。

表2 各組H1650細(xì)胞OD值比較Tab.2 Comparison of OD values of H1650 cells in each

2.3沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞侵襲能力的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組穿膜細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)；Blank組和NC組穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4、圖1。

圖1 Transwell檢測各組H1650和A549細(xì)胞侵襲能力(×400)Fig.1 Transwell to detect invasiveness of H1650 and A549 cells in each group (×400)

表4 各組H1650和A549細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)比較Tab.4 Comparison of number of transmembrane cells of H1650 and A549 cells in each

2.4沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞遷移能力的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組遷移距離縮短(P<0.05)；Blank組和NC組遷移距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5、圖2。

圖2 劃痕實驗測定各組H1650和A549細(xì)胞遷移能力 (×100)Fig.2 Scratch test to determine migration ability of H1650 and A549 cells in each group (×100)Note:A.H1650；B.A549.

表5 各組H1650和A549細(xì)胞遷移距離比較Tab.5 Comparison of migration distance of H1650 and A549 cells in each

2.5沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞E-cadhe-rin、Vimentin蛋白水平的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，Vimentin蛋白水平降低(P<0.05)；Blank組和NC組E-cadherin、Vimentin蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組H1650和A549細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of E-cadherin and Vimentin proteins of H1650 and A549 cells in each groupNote:A.H1650;B.A549.1.Blank group;2.NC group;3.si-DGCR5 group.Compared with Blank group, *.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05.

2.6沉默DGCR5對H1650和A549細(xì)胞β-cate-nin、p-gsk-3β蛋白水平的影響 H1650和A549細(xì)胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)，p-gsk-3β蛋白水平升高(P<0.05)；Blank組和NC組β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

表3 各組A549細(xì)胞OD值比較Tab.3 Comparison of OD values of A549 cells in each

圖4 各組H1650和A549細(xì)胞β-catenin、p-gsk-3β蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of β-catenin and p-gsk-3β proteins of H1650 and A549 cells in each groupNote:A.H1650;B.A549.1.Blank group;2.NC group;3.si-DGCR5 group.Compared with Blank group, *.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05.

3 討論

肺癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率居高不下，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%，且其5年生存率較低。NSCLC死亡的主要原因為早期臨床癥狀不明顯，臨床確診時通常已進(jìn)入晚期階段，癌細(xì)胞已發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。肺腺癌為NSCLC的一種，治療方法包括手術(shù)治療、放療、化療、靶向治療等，但上述治療方法對于發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者效果欠佳，預(yù)后較差[8]。因此探討肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，盡早抑制肺腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義。

lncRNA是一類由于缺乏開放式閱讀框而導(dǎo)致缺乏蛋白編碼能力的RNA，可通過對基因的表達(dá)和翻譯參與調(diào)控惡性腫瘤的生物學(xué)功能，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移及放化療抵抗等過程中發(fā)揮重要作用[9]。研究已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10]。DGCR5作為一種lncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[11]。DGCR5在乳頭狀甲狀腺癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低，上調(diào)DGCR5可抑制上述惡性腫瘤的進(jìn)展[12-14]。DGCR5在肺癌中也存在異常表達(dá)，Chen等[15]和Luo等[16]研究發(fā)現(xiàn)DGCR5在肺癌組織中表達(dá)降低，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用；Dong等[17]和李楠等[18]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中DGCR5呈高表達(dá)，對肺腺癌的診斷和預(yù)后評價具有重要意義，在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用。本文通過沉默DGCR5觀察其對肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)沉默DGCR5可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，本研究結(jié)果表明DGCR5在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用，抑制肺腺癌細(xì)胞中DGCR5表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，DGCR5有望成為肺腺癌的潛在治療靶點。本研究結(jié)果與Dong等[17]和李楠等[18]研究結(jié)果一致，與Chen等[15]和Luo等[16]研究結(jié)果不一致，考慮其原因可能為本研究及Dong等和李楠等的研究對象為肺腺癌，而Chen等和Luo等的研究對象為肺癌，提示DGCR5在不同的肺癌類型中所發(fā)揮的作用可能不完全相同。

研究表明DGCR5參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚不明確。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤性是癌細(xì)胞的重要生物學(xué)特性，多數(shù)肺腺癌患者并非死于肺腺癌本身，而是隨之出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移。EMT在肺腺癌的侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化成具有間質(zhì)表型細(xì)胞的一種生物學(xué)過程，E-cadherin表達(dá)下降和Vimentin表達(dá)升高為EMT的主要特征。EMT后上皮細(xì)胞失去原細(xì)胞極性和基底膜連接等上皮細(xì)胞表型，獲得高遷移和侵襲能力[19，20]。因此EMT是上皮來源細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)沉默DGCR5可升高E-cadherin蛋白水平，降低Vimentin蛋白水平。提示下調(diào)DGCR5可能通過抑制肺腺癌細(xì)胞EMT發(fā)揮抑制肺腺癌侵襲遷移能力。

Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt通路，和胚胎發(fā)育及細(xì)胞的生長、分化、凋亡等關(guān)系密切，還與EMT相關(guān)，Wnt/β-catenin信號通路可降低E-cadherin表達(dá)，使上皮細(xì)胞連接和極性缺失，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[21]。當(dāng)Wnt信號通路被激活后，信號傳導(dǎo)至p-gsk-3β，使降解復(fù)合物失活，導(dǎo)致細(xì)胞中β-catenin不能被降解，從而使β-catenin水平升高，p-gsk-3β水平降低[22]。DGCR5在惡性腫瘤中可通過信號通路發(fā)揮作用，如Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)DGCR5可通過激活Wnt信號傳導(dǎo)影響宮頸癌的增殖、遷移和侵襲；Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)DGCR5可通過Wnt信號傳導(dǎo)途徑影響肝細(xì)胞癌進(jìn)展。因此推測DGCR5可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響肺腺癌的增殖、侵襲和遷移，故本文對其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)下調(diào)DGCR5后，H1650和A549細(xì)胞中β-catenin蛋白水平降低，p-gsk-3β蛋白水平升高。表明DGCR5可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，下調(diào)DGCR5可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路及肺腺癌細(xì)胞EMT抑制肺腺癌的增殖、侵襲和遷移。DGCR5有望成為肺腺癌新的治療靶點。