劉 磊 吳一飛

(陜西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，咸陽 712046)

急性腦缺血是臨床常見的腦血管疾病，可導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)元損害引發(fā)神經(jīng)功能障礙[1]。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血實驗大鼠腦皮層紋狀區(qū)可在受到缺血缺氧性信息刺激后激活神經(jīng)元一氧化氮合酶(nNOS)的表達，經(jīng)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)nNOS陽性神經(jīng)元顯著增多，且對維持炎性反應(yīng)的發(fā)展、誘發(fā)并加重皮層紋狀區(qū)神經(jīng)元損傷具有至關(guān)重要的作用[2]。另有研究報道，急性腦缺血實驗大鼠造模24 h后大腦皮層紋狀體脫失明顯，nNOS陽性神經(jīng)元顯著增多，其中大腦皮層紋狀體是nNOS的主要來源，可損傷神經(jīng)細胞，誘發(fā)膠質(zhì)細胞壞死[3]。故在急性腦缺血治療中應(yīng)積極控制大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量和活性。牡荊苷是從牡荊葉和牡荊子中提取的黃酮類化合物，在既往的報道中證實牡荊苷對急性腦缺血大鼠具有抗氧化應(yīng)激活性和腦保護作用[4，5]。牡荊苷是否能夠調(diào)控急性腦缺血大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量和表達，以減少神經(jīng)元細胞凋亡尚鮮有報道。本研究選取50只雄性SD大鼠開展實驗，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 50只SD雄性大鼠，SPF級，6～8周，體質(zhì)量180～220 g，均購自西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(陜)-2018001。

1.1.2試劑與儀器 牡荊苷(上海經(jīng)科化學科技有限公司，純度HPLC≥98%)；2%戊巴比妥鈉(諾華制藥有限公司)；磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物公司)；4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液、兔抗鼠nNOS、β-actin，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(美國Sigma 公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL)試劑盒(艾美捷科技有限公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)。

EG1150型石蠟包埋機、RM2235型組織切片機(德國Leica 公司)；BX53型光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；905型恒溫冰箱(美國Thermo 公司)；7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(美國Axygen公司)；50W-X8型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分組和建模方法 將50只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只，除假手術(shù)組外均采用線栓左側(cè)大腦中動脈法建立急性腦缺血模型，具體操作：采用改良Longa法造模，選用白色日本尼龍魚線(直徑 0.23 mm)，在插入端蘸聚酯成光滑紡錘狀，在距離插入端大約18 mm的位置進行標記[6]。取40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹腔麻醉，于頸部做正中切口，將左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈分離并暴露，對頸外動脈分支電凝，結(jié)扎并游離其主干遠端。自頸外動脈殘端起始部位將拴線插入，插入深入距離頸總動脈分叉處大約為17.5～18.5 mm，若遇到阻力則停止操作，將拴線固定并結(jié)扎縫合。假手術(shù)組操作過程同上，但不結(jié)扎栓線。大鼠清醒后，將同時具有以下3項者即為建模成功：①左側(cè)Horner征，即眼裂變小、眼球下陷；②爬行時向右側(cè)劃圈且步態(tài)不穩(wěn)；③提尾時右前肢內(nèi)收屈曲，向右上方旋轉(zhuǎn)。

1.2.2干預(yù)方法 確認建模成功后模型組和牡荊苷劑量組均立即予以干預(yù)，假手術(shù)同時予以干預(yù)，其中假手術(shù)組和模型組均給予0.01 ml/g體質(zhì)量生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量組分別給予1.62、3.24、6.48 μmol/kg牡荊苷溶于0.01 ml/g體質(zhì)量生理鹽水中腹腔注射(低劑量組所用劑量為牡荊苷的臨床等效劑量，中劑量組、高劑量組所給劑量分別為牡荊苷臨床等效劑量的2倍、4倍)，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3干預(yù)前后神經(jīng)行為學變化 以神經(jīng)行為學評分表評價各組干預(yù)前后神經(jīng)行為學變化，包括身體對稱性、45°斜面爬行、步態(tài)、轉(zhuǎn)圈、前肢對稱性、強迫轉(zhuǎn)圈、Whisker反應(yīng)共7個項目，每個項目分別以0分表示正常，1分表示輕微異常，2分表示明顯異常，3分表示顯著異常，4分表示嚴重異常，共0～28分，評分越高認為神經(jīng)行為學異常越嚴重[7]。

1.2.4TTC法檢測腦梗死體積 所有大鼠干預(yù)后同1.2.1方法實施腹腔麻醉，解剖心臟，于左心室進針，將右心耳剪開以磷酸鹽緩沖液灌注，待流出液體澄清后灌注4%多聚甲醛，多聚甲醛灌注量約和磷酸鹽緩沖液灌注量相同。觀察大鼠舌體和肝臟變化，完全變白后放置于冰塊上斷頭并迅速取腦組織。在-20℃恒溫冰箱中冷凍15 min，冠狀位切5等份，放置于預(yù)熱的2% TTC溶液中，37℃避光保存0.5 h，紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織，腦梗死體積(%)=蒼白區(qū)質(zhì)量/總質(zhì)量×100%。

1.2.5TUNEL法檢測缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率 對腦梗死組織脫水、包埋、連續(xù)切片(層厚4 μm)，對切片采用TUNEL試劑盒檢測缺血性神經(jīng)元細胞的凋亡情況，并以光學顯微鏡觀察。

1.2.6ABC免疫細胞化學法檢測大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元 按照上述方法做切片，60℃烘烤1.5 h，二甲苯透明處理，梯度濃度酒精水化處理。加入0.1%過氧化氫封閉，室溫下等待0.5 h，加入1∶10第二抗體來源的正常山羊血清，室溫下等待1 h。加入1∶2 000兔抗nNOS 多克隆抗體，4℃下等待48 h。PBS沖洗后，給予1∶100 ABC復(fù)合物，4℃下等待24 h。PBS沖洗，加入顯色液(0.05%顯色劑+0.01%過氧化氫)，顯色5～7 min，以PBS終止染色，并沖洗。乙醇脫水，二甲苯透明后封片，以光學顯微鏡觀察染色結(jié)果，并將圖像信息傳輸至IPP5.0軟件分析系統(tǒng)，測得nNOS積分光度值(IOD)。

1.2.7qRT-PCR檢測大腦紋狀皮質(zhì)nNOS mRNA表達方法 參照《大鼠腦立體定位圖譜》[8]中標記的具體解剖位置取大腦紋狀皮質(zhì)組織約1 mm×1 mm×1 mm，清洗并保存于-80℃的恒溫冰箱中，按照TRIzol說明書方法提取總RNA，取1 μl將其作為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin mRNA作為內(nèi)參，nNOS引物序列：上游5′-GCGCGGTTACGACTGCT-AGCTG-3′；下游5′-ACTGCTCGATATCTAGTCAAAC-3′；β-actin引物序列：上游5′-TCCGATATAGCTAAACTAGCTA-3′；下游5′-CGCTAGCTAGCTAGCTAG-TTGA-3′。常規(guī)配置反應(yīng)體系，實施擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 20 s， 72℃ 20 s，共進行35個循環(huán)后，72℃ 5 min。以β-actin mRNA對反應(yīng)產(chǎn)物進行定量校正和判定，將其拷貝數(shù)作為矯正基數(shù)，將nNOS mRNA的循環(huán)閾值(Ct)值與β-actin mRNA的Ct值求差，可獲得ΔCt，2-ΔΔCt即為nNOS mRNA的相對表達量。

1.2.8Western blot法檢測大腦紋狀皮質(zhì)nNOS蛋白表達 按照上述方法取大腦紋狀皮質(zhì)組織約 1 mm3，加入液氮研磨，勻漿后離心取等量蛋白樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉處理，根據(jù)PVDF膜蛋白標記分子量，在其相應(yīng)分子量標記位置剪取nNOS蛋白(155×103)、β-actin(37×201)條帶。分別加入兔抗鼠nNOS、β-actin(1∶1 000)4℃過夜，并加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫搖床孵育2 h，曝光后以圖像分析軟件分析nNOS蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1各組干預(yù)前后神經(jīng)行為學評分對比 模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組分別有2只、3只、2只和1只建模失敗，假手術(shù)組有1只死亡。假手術(shù)組干預(yù)前后神經(jīng)行為學評分無變化(P>0.05)，模型組干預(yù)后較干預(yù)前增加(P<0.05)，牡荊苷劑量組均較干預(yù)前降低(P<0.05)，且干預(yù)后高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每2組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組干預(yù)前后神經(jīng)行為學評分對比分)Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores before and after intervention in each

2.2各組腦梗死體積對比 假手術(shù)組無梗死灶，除假手術(shù)組外，其余4組腦梗死體積對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每劑量組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組腦梗死體積對比Tab.2 Comparison of volume of cerebral infarction in each

2.3各組腦梗死組織缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率對比 假手術(shù)組無缺血性神經(jīng)元細胞凋亡，模型組可見大量TUNEL染色陽性細胞，杜荊素劑量組TUNEL染色陽性細胞均減少，且以高劑量組最少，見圖1；模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每劑量組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組腦梗死組織缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率對比Tab.3 Comparison of apoptotic rates of ischemic neurons in cerebral

圖1 各組腦梗死組織TUNEL染色結(jié)果(×200)Fig.1 TUNEL staining results of cerebral infarction tissues in each group(×200)

2.4各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元定性和定量結(jié)果對比

2.4.1定性結(jié)果 大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元多呈棕褐色染色，陽性物質(zhì)主要位于細胞漿內(nèi)，胞核透亮，陽性細胞的形態(tài)多變，體積小，且陽性細胞體多呈梭形或圓形，每個細胞可見1～3個纖細且長的突起，伸向腦缺血病灶方向。假手術(shù)組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元稀疏、散在，陽性染色較淺；高劑量組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元稍密集，著色稍深；中劑量組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元密集，著色加深；低劑量組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元密集分布；模型組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元分布最為密集，見圖2。

圖2 大腦紋狀皮質(zhì)nNOS免疫陽性神經(jīng)元檢測(×100)Fig.2 Detection of nNOS immunoreactive neurons in striate cortex of brain (×100)

2.4.2定量結(jié)果 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS IOD值對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中假手術(shù)組 <高劑量組 <中劑量組<低劑量組<模型組， 每劑量組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS IOD值對比Tab.4 Comparison of nNOS IOD values in striate cortex of brain in each

2.5各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS mRNA表達對比 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS mRNA表達對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中假手術(shù)組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每兩組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS mRNA表達Tab.5 nNOS mRNA expression in the striate cortex of brain in each

2.6各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS 蛋白表達對比 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS 蛋白表達對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中假手術(shù)組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每兩組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6、圖3。

表6 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS 蛋白表達Tab.6 Expressions of nNOS protein in the striate cortex of brain in each

圖3 各組大腦紋狀皮質(zhì)nNOS 蛋白表達檢測Fig.3 Detection of nNOS protein expression in cerebral striate cortex of each groupNote:1.Sham operation group;2.High dose group;3.Medium dose group;4.Low dose group;5.Model group.

3 討論

急性腦缺血是常見的致死致殘疾病，在腦血管疾病中的構(gòu)成比已超過85%[9]。急性腦缺血可引發(fā)神經(jīng)元損傷，國內(nèi)外報道的可能機制包括能量衰竭、酸中毒、自由基損傷、興奮性毒性損害、免疫失衡和炎癥反應(yīng)等[10，11]。有研究指出，急性腦缺血患者神經(jīng)元損傷過程中免疫失衡是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要條件，以nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量增多和功能激活最為多見，NOS是催化產(chǎn)生內(nèi)源性NO的唯一酶類，而內(nèi)源性NO可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞間的信使分子，在神經(jīng)元電生理活動中起到重要的調(diào)控作用[12]。NOS可分為原生型和誘導(dǎo)型，前者又可分為神經(jīng)元型和內(nèi)皮型，各自執(zhí)行不同的功能，其中nNOS可能是參與急性腦缺血神經(jīng)元損傷的重要因子[13]。故調(diào)控急性腦缺血組織中nNOS的表達可能是控制病情的重要途徑。

本次研究顯示，除假手術(shù)組外，模型組神經(jīng)行為學評分、腦梗死體積、腦梗死組織缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率均高于其余3組，且在3組間對比顯示，高劑量組<中劑量組<低劑量組，表明牡荊苷在急性腦缺血大鼠中應(yīng)用能夠改善神經(jīng)行為學、減少腦梗死體積、降低缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率，且高劑量牡荊苷的作用效果最佳，中劑量牡荊苷的作用效果明顯優(yōu)于低劑量組。牡荊苷屬于天然黃酮類藥物，具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎癥反應(yīng)等作用，在既往的研究報道中已證實該藥物可調(diào)控Toll樣受體4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)mRNA及蛋白表達，控制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護作用[14]。另有研究指出，牡荊苷可改善急性腦缺血大鼠局部組織的能量代謝，從而可優(yōu)化局部微環(huán)境，為病情控制和神經(jīng)功能的改善提供依據(jù)[15]。國外一項報道中證實，牡荊苷可緩解缺血缺氧性損傷大鼠模型的神經(jīng)元損傷程度，抑制神經(jīng)元細胞線粒體凋亡，且可改善其神經(jīng)行為學[16]。因此，在急性腦缺血大鼠中牡荊苷可發(fā)揮腦保護作用。但是關(guān)于牡荊苷對神經(jīng)免疫的作用報道尚少，既往研究推測其對神經(jīng)免疫具有雙向調(diào)控作用，而其是否能夠調(diào)節(jié)急性腦缺血局部組織的神經(jīng)免疫表達仍需進一步探討[17]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元定性和定量結(jié)果均顯示，模型組最多，低劑量組次之，中劑量組稍少，高劑量組更少，假手術(shù)組最少，可知在急性腦缺血大鼠大腦紋狀皮質(zhì)nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，給予牡荊苷可降低其數(shù)量，且濃度越高效果越佳；在進一步的對比結(jié)果中顯示，大腦紋狀皮質(zhì)組織nNOS mRNA和蛋白表達量組間對比，模型組>低劑量組>中劑量組>高劑量組>假手術(shù)組，可知在急性腦缺血發(fā)生過程中大腦紋狀皮質(zhì)nNOS mRNA和蛋白表達量顯著增高，給予牡荊苷干預(yù)后可下調(diào)其表達，且高劑量牡荊苷的作用最佳。研究發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血早期，大腦皮質(zhì)多個區(qū)域均可見nNOS免疫陽性神經(jīng)元，且Western blot和免疫組化法檢測結(jié)果均發(fā)現(xiàn)其表達水平顯著增強，以皮層紋狀區(qū)、海馬始層、腔隙層等較為常見，且大腦紋狀皮質(zhì)中其免疫陽性神經(jīng)元最多，蛋白表達量最高，是其他區(qū)域免疫陽性神經(jīng)元的主要來源[18]。在進一步的研究中顯示，缺血早期上述區(qū)域nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量與神經(jīng)元細胞凋亡率呈正相關(guān)，推測nNOS免疫表達增強是導(dǎo)致上述區(qū)域成為缺血易損區(qū)的重要原因。Shao等[19]的報道指出，大鼠大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元對缺血缺氧性損傷非常敏感，在其刺激下可顯著增加陽性表達數(shù)量，并推測很可能參與腦組織損傷和神經(jīng)缺損的壞死病變過程。結(jié)合本研究結(jié)果，推測牡荊苷可減少急性腦缺血大鼠大腦紋狀皮質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量，抑制其表達，并下調(diào)其mRNA和蛋白表達。

綜上所述，牡荊苷可改善急性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學，減小腦梗死體積，降低缺血性神經(jīng)元細胞凋亡率，且劑量越高作用越佳，推測與減少達到大腦紋狀皮質(zhì)組織nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量，抑制其免疫表達，下調(diào)其mRNA和蛋白表達有關(guān)，為急性腦缺血患者的臨床治療研究提供了新方向。但關(guān)于牡荊苷對皮層紋狀區(qū)nNOS免疫表達的調(diào)控機制仍需要深入探討，可作為進一步的研究方向。